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[核酸提取] 请教:从肌肉组织提取DNA ^_^



请教:从肌肉组织提取DNA ^_^

各位好!想咨询一下关于从肌肉里提取DNA的步骤,还有一些注意事项之类的。谢谢了

[ 本帖最后由 elvira_4 于 08-8-21 09:50 编辑 ]

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(1)匀浆液
Tris-HCl        100mmol/L(pH8.0)
EDTA           50mmol/L (pH8.0)
NaCl              500 mmol/L
灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液
10%SDS
(3)去蛋白液
5mol/L KAc
(4) RNaseA
10mg/ml
(5) Proteinase K
10mg/mL
(6) 无水乙醇
(7) Elution Buffer
3. 仪器: 离心机, 恒温水浴, 台式高速离心机,电泳装置
二 实验程序
1.        取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。OR 取100mg 组织,加500μL提取液,匀浆;
2.        向管中加入100μL10%SDS溶液,加入Proteinase K至终浓度100ug/mL,RNaseA至100ug/mL混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ,60℃保温4h~O.N.,并不时摇动。
3.        加入150μL 5mol/L KAc,混匀,置冰上20-30 min。
4.        4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,若上清仍有颜色,则可极其缓慢地一滴滴加入0.35V的无水乙醇, 边加边迅速混匀, 4℃放置20min, 12000g, 4℃离心5min, 取上清(此步为可选步骤,可去除多糖,但要损失约10%的DNA)
5.        12 000rpm离心10min取上清,加入2V的无水乙醇,-20℃沉淀30 min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
6.        电泳检测完整性。

此方法为普通动物组织DNA的通用提法,对小鼠的肌肉、鼠尾小量提取效果很好,我自己有做斑马鱼的肌肉和胚胎,效果也不错。
这里要注意的就是裂解后的纯化,上面给出的是利用高盐除蛋白,35%乙醇除多糖,这种纯化纯度很好,但得率不是特别高,因此如果是做PCR等实验,推荐这种方法,如果是做southern等需要大量genomicDNA的实验,用酚仿抽提+乙醇沉淀,得率会高一些。
此外就是genomicDNA提取的通用注意事项了,剪枪头,无菌什么的,就不赘述了。
本帖最近评分记录
  • kay0205 威望 +1 经验之谈 08-8-22 09:44
钞票并不是万能的,许多时候还要用到信用卡。

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