老板让构建表达载体，给了一个实验步骤（不是老板自己写的，他也是找人弄得），先将cDNA连接到pPMD18-T载体，之后经过酶切等步骤后又连接到pUC18载体里，之后才连接到表达载体pPCV里，我想请教的是为什么要进行两步克隆载体的构建后才连接到表达载体里？只用一个可以吗？如果不行，pPMD18-T载体和pUC18载体的作用各是什么？请教达人，多谢

我猜是酶切位点的问题吧,不然没必要再装到pUC18里一次

好像LZ也没说清楚，pUC18后是什么过程，不是简单就酶切去连接吧
从你说的看，好像成了偷懒，T载体测序后没有重新设计引物，直接切下来换酶切位点表达，这个有点.....

连接到PMD18-T上，我想更多的是为了测序需要吧，因为连接到表达载体之前，要保证序列的正确性啊。
连接到pUC18载体呢？更多的是为了获取相应的酶切位点以此和表达载体连接。
不知道你的基因序列是怎么获得的？RT-PCR?

楼主，好啊，我最近也搞这个，能不能把你的protocol发我一份参考以下！！我的qq：66774260，油箱：66774260@qq.com

首先谢谢两位版主的答疑

是这样，pPMD18-T载体构建好后进行酶切，然后补平3‘末端，连接到了平末端载体。还有请教一下nano版主，T载体重新设计引物 的优势在哪里？为什么不能直接用T载体上的酶切位点，两者对后续试验有什么影响吗？

我是做RT-PCR扩。