大家好：我做完蓝白斑筛选后，又将白斑菌做了菌落PCR，结果是做十个菌落PCR几乎都有目的条带出现，但也有很多杂带出现，请问这样的阳性克隆能送去侧序吗？造成有很多杂带出现的原因是什么？谢谢回答！

菌落PCR就是一种很粗的鉴定方法，由于模板质量差，出现非特异性扩增很正常。准确鉴定阳性克隆不能用这种方法。提质粒，做PCR都会准很多。而且阳性克隆的鉴定至少需要两种方法，比如PCR和酶切，都正确，才正确。

我做完菌落PCR以后，又提了质粒，再做PCR，杂带也多，而且也进行了单双酶切，检测没问题，测序后，我要的长度是1700bp，但测出来只有1500多bp,而且找不到我的下游引物，请问出现这种现象的原因是什么？测序公司说肯定测完了，我也不知道什么原因。是菌被污染了吗？

双酶切能确保片段长度正确吗？1700和1500+在胶上差距不大
1700你测序测了几个反应？如果是做的单向测序，2个反应比较难确保测通

但我给公司说的就是直接测通，不管几个反应。电泳是看不出来片段的具体长度，但请问造成这种现象的原因是什么啊？除了做双酶切和PCR还有其他验证方法吗？为什么目的片段是1700，但到最后却成了1500？我给公司打了几次电话，他们说肯定测通了。

如果双酶切都不可靠的话，那么测序前我还能做哪些检测啊？

测通了怎么会找不到下游引物啊？？？真的找不到的话他们就测错了！他们对没测到下游引物是咋解释的

呵呵，测序前一般的检测就是PCR和双酶切
不是说双酶切不可靠，而是，当你的测序结果不对的时候，你就该反过来想想双酶切是不是可靠。
类似的还有电泳，我们一般用电泳看下条带多大，检测下PCR产物或类似的，当结果正确时，可以成为佐证，但是反过来，结果不合理时，我们就该怀疑这些不是很定性确定的东西。

找不到引物有以下的可能：
有如下几种情况：
（1）找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为荧光测序方法采用的是荧光标记了的ddNTP，自动测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列。由于引物本身是不被标记的，所以在测序结果中也是找不到的。
（2）是找不到克隆片段的扩增引物。原因可能是您在构建质粒时所用的酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分判读不清。
（3）还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的，这时可以找一下引物的互补序列。
（4）存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点.导致只有一条引物参与扩增.

你再哪家公司测得，建议到宝生物去测，测通，或反向测通。
有杂带是引物设计得问题吧。酶切内切开说明不是引物得问题

测序的时候不要过于关注pcr的引物，因为它一般在测序的起始位置，有时候不一定能够完全测准。不知道楼主是用什么方法在测序结果中去寻找引物序列的位置，如果你是按照字符完全匹配的方式去的话，如果这个引物的序列没有完全测准的话（又或者合成的引物有突变，当然这个可能性很小了），就很可能找不到了。

判断测序结果，重点应该放在全部序列是否匹配（用NCBI的BLAST去比对后，再分析结果），不要过于局限于引物。