各位高手，我用pGEM-6p-1表达IHNV的G蛋白，跑SDS－PAGE就是没有表达，我该怎么办啊？

确定一下你的目的片段是否连接到表达载体上

pGEM？应该是pGEX-6p-1吧
1.构建是否有问题-----外源基因插入与否，读码框架是否正确；   解决方案：测序验证一下
2.表达过程是否有问题-----诱导了吗，诱导时期是否最佳，IPTG是否失效，空载体表达GST了吗；  解决方案：设立空载体的对照
3.蛋白样的处理是否有问题-----诱导后菌液如何处理的，蛋白样如何制作的；  解决方案：向实验室前辈请教
祝顺利！

做这种试验，过程要严谨，比如测序等都不要省。
还有，要想快速找到原因，实验中设置各种对照是最快的方法。

感谢各位的解答。
对照以上各位的支招，
1，测序正确，目的片段插入载体。
2，IPTG是诱导前才配的，并且同时其他人用这批IPTG诱导出了他们的目的蛋白。
3，蛋白样制作按照操作指南，没有问题。
只是没设空载体对照，下一步设对照。
因为是病毒的膜蛋白，全长表达可能有细胞毒性，如何知道是因为细胞毒性导致的不表达，各位有高招吗？谢谢！

膜蛋白表达相对较难，你应该选用融合TAG较长的载体，N端的TAG可溶性可以降低由目的基因毒性产生问题的可能性，pGEX-6p-1没用过，具体情况不清楚。尽量选用严谨型的菌株和载体，避免泄露表达，同时可以试试STUDIER的自诱导培养基控制泄露表达，并建议从转化表达菌株就开始使用此文中的培养基
http://www.genecool.com/bbs/thread-118-1-1.html
如果是因为细胞毒性导致不表达，则必然已经有少量的蛋白已经表达，可以从RNA和蛋白上入手检测看看泄露表达情况，但是个人认为为了一个克隆去做这些好像太费劲了
有生物信息学办法预测细胞毒性，好像是预测跨膜结构，具体的情况不熟悉，自己也没学好，呵呵

膜蛋白一般具有疏水区，这种疏水区会影响蛋白表达量的。

pGEX-6p-1系列的TAG为26KDa的GST，还算比较大了，由此表达的融合蛋白常在表达量和可溶性上有所增强，是一株居家旅行，馈赠亲友的必备良品........
目前的推测是你的蛋白是有可能是胞毒性的，一旦表达少量即终止表达，这种现象在我们实验室遇到过，当时也是非常纳闷为什么不表达，因为测序和表达框架都对。后来查文献发现一篇外文文献有讲，这种情况下即使有少量表达，PAGE也分辨不出来，于是后来做了个截短表达，顺利地表达了一部分，希望对你的实验有参考

设空载体对照的结果，有GST表达，很大可能是蛋白有细胞毒性。因为我们后期工作的目标是该蛋白的疏水区，截短是不可取的。各位高手，如何克服有细胞毒性的蛋白原核表达，有没有个好办法啊？

[ 本帖最后由 lucysuper 于 08-8-8 12:10 编辑 ]

一个原则，避免泄露表达