用提取的克隆质粒为模板，想P个500多碱基的单链，选择了不对称PCR的方法如下：
     第一：直接设置不对称引物，做了1：50和1：100两个浓度。
     第二：先做普通pcr，然后从产物中直接取了点为模板，加入一条引物做pcr。
     电泳，goldview为染色剂。
      结果：都有很淡的引物二聚体存在。方法一中，1：50泳道看不到任何带，1：100有500多的条带。方法二，均能看到500多的条带，但是很淡。都看不到goldviws号称的结合单链发出的橙红色荧光，全部为绿色荧光。
     求助：我怎么才能知道自己是否成功P出了单链？方法一中，为什么两对引物浓度对比小的一组反而看不见条带？

这玩意没有做过啊，但明白是怎么回事啊。
有个问题，单链的分子量分析是否要特定的MARKER呢？
至于goldviws号称的结合单链发出的橙红色荧光，这个我想好难看到啊，平时ＰＣＲ都Ｎ多次啊，都没有见过啊．
但我想你的ＰＣＲ循环数应该挺重要的，至于模板浓度应该要少点，这要才会让单链产生的机会大一点．

可以通过比较变性和非变性的胶来确定是否要的单链

不对称PCR的引物浓度是需要摸索的

限制性引物的浓度需要控制的比例

不对称PCR有效的签定方法还是通过与探针的杂交。
变性胶也可以，不过灵敏度可能不会很高。
另外，如果你仅仅是在引物浓度方面调整，建议把引物的浓度提高一些，从1：1做到1：30，也许你会有意外的发现。