我用pfu酶扩增出的目的条带,用酚氯仿抽提,酒精沉淀后,再用taq酶加A尾,浓缩后电泳,用的是0.8%胶.电泳后条带很清晰也挺浓的,但是用凝胶回收试剂盒回收后再电泳怎么也看不到目的条带,这是为什么呀?哪个高人能给我指点指点.......我用的是上海生工的试剂盒,不会是试剂盒的问题吧?

至少给个起始量再讨论吧？
胶回收回收效率低的可能因素：
1、试剂盒的问题：（1）binding buffer（叫法不一，就是高盐溶胶液）有沉淀，解决——37度加热溶解即可；（2）washing buffer忘加酒精，或长时间开盖，造成酒精挥发，造成洗涤时带走部分DNA；（3）洗脱液pH过低（染菌或其他因素造成），造成洗脱效率不高，解决——自行配制10mM Tris-Cl（pH 8.5）或TE洗涤。
2、自己操作的问题：（1）胶块过大，一方面造成混合液中杂质过多，影响DNA与硅机制的结合；另一方面造成混合液体积过大，人为稀释目的DNA的浓度，减弱其与硅基质的结合；（2）溶胶过后，由于切胶过程有可能带入过多电泳缓冲液和Agarose，造成混合液pH过高，而DNA与硅基质结合的条件是高盐低pH，解决——溶胶后加入1/10体积的pH5.2的3M NaAc；（3）电泳缓冲液的选择，由于TBE中的硼酸有可能和DNA形成聚合物，从而降低回收率，因此回收时一般都用TAE制胶和电泳；（4）洗脱体积过小，未充分浸润硅基质，造成部分DNA损失——按照说明书推荐的洗脱体积来洗脱。
3、忘了物质守恒：这在目前是很多人忽略的，也是“不给老板省钱、没结果就是试剂烂”等心理带动下大量出现的问题。一般试剂盒回收率在40%~90%之间，5、60%的效率比较常见，我们就以50%的回收率为例说明。假设你初始20uL体系，一般PCR35个循环1000bp产物的浓度多在25~75ng/uL左右，pfu略低，我们就算50ng/uL吧，假设20uL体系全部电泳，那就是1ug的起始量，一般公司的最小洗脱体积在20~40uL之间，我们按30uL，那么在50%回收率下，我们可以洗脱500ngDNA，浓度差不多是不到20ng/uL，如果你只点1uL电泳检测，基本就是隐隐约约的带啊，可能不注意就看不见了。因此在考虑试剂盒和操作原因之前，要对自己的起始和回收的可能情况做个大致判断，这样才能更好的解决问题。

来说说我的具体操作吧:
       我先用50ul的体系用pfu酶进行PCR,一共做了四管。然后我将四管一起用酚氯仿抽提，酒精沉淀，再用152ul水溶解。接着加入Taq酶的反应缓冲体系至200ul，分成四管在72度延伸15分钟之后将其中的150ul直接用酒精沉淀后用25ul水溶解。然后电泳，上了两个孔，切下的胶有114mg。按照试剂盒的说明书操作，最后用20ul洗脱液洗脱的。再电泳检测点的是10ul啊！可是什么都看不见。
    试剂盒是新买的，wash  solution也加过乙醇了。顺便说一下，我的目的条带是1.8kb左右

老兄,你不用这么复杂啊,
我教你做啊,
(1)不用P那么多都行了,一管50ul就好了,先PCR后跑电泳用胶回收试剂盒回收你的片段;
(2)用回收的片段用TAQ+A;
(3)将加A后的DNA直接用胶回收试剂盒再回收一次,
(4)将片段与T载体连接.

一次搞掂.祝实验顺利

我了解的基本都在上面了，如果lz分析不是操作和试剂的问题，可以考虑是不是kit的问题。
至于平端PCR产物加A，以下是我加A的步骤，pfu扩增，原液直接加入rTaq+终浓度2mM的dATP（非必须，但可提高效率），72度15min，电泳切胶，打完收工。

[ 本帖最后由 biobowl 于 08-7-10 22:03 编辑 ]

你为什么不直接用加A 的taq酶做呢，EXtaq
然后直接胶回收目的条带

Extaq E是保真性和效率的折中方案，当然如果放心还是可以直接用ExTaq甚至LA Taq（都是rTaq和pfu的混合酶），如果真的是要追求保真性，比如做点突变啊什么的，还是pfu等平端酶来的有说服力些。
当然这个也是带有个人主观的选择倾向，看个人吧，你可以选择exTaq，也可以选择pfu+A，多个protocol多条路。

[ 本帖最后由 biobowl 于 08-7-10 22:45 编辑 ]

学我那样做啊，
只要一次跑胶，简单啊，没有dATP也可以用dNTP,

谢谢回答!可是第一步用胶回收后不是没有引物什么的了吗?那还可以用Taq酶加A尾?

原液直接加Taq的话会不会因为缓冲体系不一样而影响pfu酶的作用?