小弟菜鸟一个，请教各位达人几个问题
1、加入酶切位点后常常不能保证正确读码框，一般是在酶切位点后加入碱基补平，那么这些碱基是随意添加还是有什么规矩呢？
2、各位都有什么软件呢，有人推荐primer＋oligo，前者搜引物对，后者评价，这样会不会太麻烦？
3、比如我想将pcr的产物克隆到表达质粒当中，只要在表达质粒的读码框内插入，5”引物就不用加ATG了吧？
4、NCBI上的参考序列都是单链的，就是编码链是吗？mRNA序列都是没有U的，就是外显子的编码链U换成T吗？

第一个问题:你有点误解了,正常的酶切位点是不会影响到正确的读码框的,而加碱基是保护酶切位,有利于克隆的进行;
第二个问题:软件,个人喜欢吧,我一般就用primer 5.0就OK, 对整个PCR都了解了;
第三个问题:对啊,但要注意酶切位点啊,一般都是识别六个的为主;
第四个问题:是的,对的.

谢谢tieniu03的热心回答

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