请教各位高手  最近我在做质粒酶切鉴定的时候  双酶切后  只有一条质粒条带  而没有目的基因条带  而我做质粒PCR的时候挑的10个菌有9个是阳性的   可为什么酶切鉴定就只有质粒条带而没有目的条带呢  ？？？

有可能是：
1、PCR假阳性，目的片段没有克隆进去；
2、质粒构建正确，但是酶切出了问题，例如质粒提的不好，导致酶切失败。

1.如果是假阳性 那10个中有9个都是吗
2.如果是质粒提的有问题  那问题应该是出在哪里了呢

引用:

原帖由 susan17931793 于 08-7-7 10:32 发表
1.如果是假阳性 那10个中有9个都是吗
2.如果是质粒提的有问题  那问题应该是出在哪里了呢

1.不要怀疑假阳性的存在，通常我会做个阳性对照，当条带亮度接近阳性对照时我才认为这个不太可能是假阳性，如果是弱弱的一条带，我通常做假阳性处理，特别难做的产物不算哈。

2.有些质粒不能在宿主菌种稳定复制 ，导致在培养过程中会丢失目的质粒，可以尝试加大抗生素的量，
3.另外，楼主是确信是没有目的片段？是不是双酶切额失效成了单酶切？（看看你的酶切带多大，是不是质粒+目的带）；
4.最后，如果你的片段是小分子片段，那么长时间电泳会检测不到噢！

[ 本帖最后由 kay0205 于 08-7-7 12:40 编辑 ]

我想先用一个酶切 然后回收 在用另一个酶切  在跑电泳看   刚刚先用一个酶切的  可是有拖尾现象  这是为什么呀

1.凝胶问题，琼脂质量不是很好，铰链不均一或含有杂质，
2.电泳电压的问题，电压过高会呈现火箭状，一般5V/CM
3.上样量过大时也会出现轻微拖尾
4.部分降解,可能是酶切时间比较长，发生末端降解；也可能是在电泳过程中发生的降解

不知道你的拖尾多严重，不过，只要有明显的目的带区，就可以回收了，回收的时候小心点，尽量切薄点，应该不是问题的。

你的基因片段是多少？是否因为片段小而没有仔细观察到
PCR鉴定，你做对照了吗？是菌落PCR还是重组质粒的PCR?

我昨天分别进行了单切    结果还是没有目的条带  今天准备做一个单切 然后用完整质粒的双酶切做个对照

我的片段为465BP  做的是菌落PCR  怎么做对照呢

你做单切的时候，有没有看看酶切产物和空载体的差别啊？如果两个大小一致，那肯定是假阳性了；

400多的片段太小了点，跑电泳的时间不要太长，要不就看不见了