请问：为什么用Primer Premier5.0软件得到的引物，在引入了酶切序列后，其Rating值一直居低不上，在引入酶切序列后，是否还需要考虑Rating值，Tm等？另外，我需要PCR全部的目的基因，但是Rating值高的引物都位于目的基因序列的中间，是否意味着前面部分的目的基因将不被克隆，为了克隆道全部的目的基因，那么选择Rating低的pairs可以吗？谢谢各位大侠了！！

哦，还有就是明明我要克隆的那段基因BARF1文献上面写的是DNA病毒来源，可是为什么其他文献都说是cDNA呢？谢谢！

等待高手解答～，hoho

反正没有人回答，我再补充一个问题，启动子到底是什么，如果只知道TATA盒在哪里，那么怎么知道要克隆哪段才是启动子呢？

1.先来看下Primer premier5的Rating计算公式:
Formula for Determining Single Primer Rating
Rating = 100 - (ΔG (Dimer)*1.7 + ΔG (Hairpin)*1.4 + ΔG (False Priming)*1.5)

Formula for Determining Primer Pair Rating
Rating = Average of sense and anti-sense primer rating - ((Tm difference between primers) * 1.7) - (ΔG Cross Dimer) * 1.3))

所以，在你引入了酶切序列后，会导致引物的Dimer、Hairpin、False Priming的ΔG发生变化，以及两条引物间的Tm差值、Cross Dimer的ΔG发生变化，最后使Rating值较低。个人做法：设计引物看参数是否合适的时候不考虑引入的酶切序列。

2. “我需要PCR全部的目的基因”，这个什么意思，没理解.

3. 病毒DNA转录生成mRNA,和mRNA互补的就是cDNA.

4.启动子是位于结构基因5，端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。关于启动子推荐两个帖子：
http://bbs.genecool.com/viewthre ... amp;page=1#pid42703
http://bbs.genecool.com/viewthre ... amp;page=1#pid71602

太谢谢楼上了，我的意思是PCR含有启动子及其上游序列的基因片段，但是根据Rating高的就不能克隆到启动子及其上游的调控序列了。非常谢谢！