好久没来了，呵呵，自己都不知道再忙什么
有个同学问我，他根据同源区设计引物之后，引物长度达到20bp（同源的碱基数），他不需要加酶切位点。但是设计完之后发现有一条上游引物完全没有G，但是gc含量符合要求，还有一条A碱基特别少，当然其它的条件都还好，基本符合要求，还有一条有连续的4个C碱基，想知道这样的引物能不能有效。
另，不加酶切位点是否可以加保护性碱基。

在引物设计中，其他都没有问题，但是连续4个C很有可能带来错配问题；
然后酶切位点的保护碱基，一方面是为了不使酶无法识别序列而失效，另外就是酶切后酶切位点就不存在序列中了，
不知道你的目的片段是做什么用的，只要不合你的目的冲突就不要紧的，比如，你要用于表达，你的“保护碱基”位于CDS外（包括不影响读码框），则无所谓；但如果影响了读码框或在CDS内，恐怕就不行了

谢谢楼主！
扩增的序列是一种分离自鹿的病毒治病基因，只要测出序列具体是什么就行。领会精神了，谢！！

引物设计的关键还是在于保守区域的选择。
在一个保守区域内，再差的引物都可以扩增成功，差异只是扩增效率有所不同。
至于很多文献上提到的规则，至少我在应用时发现没有严格遵守并不影响结果，保守区域是非常非常关键的，比对尽可能多的序列，并适当参考文献，即可设计出合适的引物。