准备用E.coli BL21(DE3)表达蛋白，但查大肠杆菌稀有密码子表出现2个：Escherichia coli O111:H- [gbbct]: 7 CDS's (2086 codons) 和Escherichia coli O127:H6 [gbbct]: 1 CDS's (157 codons) ，不知是哪个。查了半天还是没头绪啊。另以Rare Codon Calculator (RaCC) {网址：http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/}在线分析稀有密码子，它只是提供arginine (AGG, AGA, CGA), leucine (CTA), isoleucine (ATA), and proline (CCC)4种氨基酸的分析结果，那另外几种可以不考虑吗？还请高手指点啊，多谢！！

准备用E.coli BL21(DE3)表达蛋白，但查大肠杆菌密码子表出现2个：Escherichia coli O111:H- [gbbct]: 7 CDS's (2086 codons) 和Escherichia coli O127:H6 [gbbct]: 1 CDS's (157 codons) ，不知是哪个。查了半天还是没头绪啊。另以Rare Codon Calculator (RaCC) {网址：http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/}在线分析稀有密码子，它只是提供arginine (AGG, AGA, CGA), leucine (CTA), isoleucine (ATA), and proline (CCC)4种氨基酸的分析结果，那另外几种可以不考虑吗？还请高手指点啊，多谢！！

arginine (AGG, AGA, CGA), leucine (CTA), isoleucine (ATA), and proline (CCC) ,Arg codons (AGG and AGA), 八个E.coli稀有密码子不是都在了？难道lz混淆了稀有密码子和必需氨基酸？

[ 本帖最后由 biobowl 于 08-6-15 11:07 编辑 ]

非常谢谢版主指点啊！但我查到的稀有密码子如下：
精氨酸：AGA,AGG,CGA,CGG
半胱氨酸：UGU,UGC
甘氨酸：GGA,GGG
异亮氨酸：AUA
亮氨酸：CUA,CUC
脯氨酸：CCC,CCU,CCA
丝氨酸：UCA,AGU,UCG,UCC
苏氨酸：ACA
所以才有疑问，还请多多指点。

一般对原核表达影响较大的就是上面提到的8种，而且这8种也不是说有了就表达不了，一般来讲真核基因都多多少少的含有大肠杆菌的稀有密码子，但发生不表达，表达中断（这里说的不表达很大可能是提前中断，造成表达片段过小未被检测到）几率不是很大，除非遇到连续的3~5个以上的稀有密码子串。一般的零星分布稀有密码子对表达的影响不大，当然如果追求产量，可以做密码子最优化，但是做实验的话，与其做多个点突变，还不如直接多接几瓶菌，一样得到蛋白，哪个工作量大谁心里都清楚。因此我认为在这个上面不用太钻牛角尖。
与其小心翼翼的乱猜，不如直接做个小试看看，克隆到表达一个礼拜怎么也有结果了吧，其实原核的T7系统是很成熟的，许多帖子讨论表达的条件优化，其实多是量上和产物可溶性的优化，直接1mM IPTG，37度，诱导4小时，如果可以表达，肯定就有带，该怎么优化那是下一步的事情。实验之前是要做好准备，但不能走极端，表达载体、纯化标签、读码框什么的一定要保证没错，这只要是认真点都不会有错，这是肯定在我们掌控内的，至于稀有密码子的问题，其实就是一个大致的原则，不是绝对的，还是做个小试来的快。
如果小试结果有影响，也不是非要做点突变，换个表达菌就得了，常用的BL21(DE3)codenplus RIL什么的，你可以去保藏中心看看，选择多了去了，交换购买什么的方便的要死。

[ 本帖最后由 biobowl 于 08-6-16 14:17 编辑 ]

谢谢版主！！对，先作一下看看，在线分析结果提示没有连续的3个稀有密码子，想的太多了，呵呵

据《分子克隆》上说 rosta菌可以高表达稀有密码子 不知道效果怎么样，最近可能试试，过一阵发结果来！！

等楼上的好消息

这个没有对比什么也看不出来，毕竟稀有密码子只有成串，大量分布才会影响表达，理论上稀有密码子越多，表达量越低，但是究竟是不是一个线性的关系，情况太多，谁也不敢说。至少我自己做一个含6%左右稀有密码子的基因，用BL21（DE3）和BL21 codenplus RIL（含有表达稀有密码子的基因）分别表达，从表达水平和表达量上看不出差别，很能有但可能不大，但不能说针对稀有密码子的表达菌无用。
这类菌多是在相应的表达菌株的基础上，导入了表达稀有密码子对应的tRNA的质粒(多是氯霉素抗性），进而解决稀有密码子的问题，这类菌在稀有密码子极大的影响了表达的情况下猜显示出优势。
我自己也做过一个20kD左右的蛋白，一开始在BL21（DE3）中表达时，不管怎么调整，总是出两条带，一条较浅在20kD，一条较深在17kD左右，质谱分析都是我的蛋白，百思不得其解。后来经分析发现该基因下游有出现大肠杆菌的稀有密码子串，因而造成了翻译的提前终止，只有少量的mRNA得到了全表达（20kD），而大部分只是部分全长（17kD）。因而我换用了BL21 codenplus RIL，经表达发现只出一条20kD的带，也就是基因得到了全表达。因而推荐在出现问题（诱导条带分子量与预期有差别或者表达水平远低于其他基因表达水平）后，仔细分析一下是否是稀有密码子造成的，如果有可能，再使用特殊菌试试。一般的基因两类菌是看不出差异的。

[ 本帖最后由 biobowl 于 08-6-17 22:26 编辑 ]

呵呵，我分析了下我的基因，512个密码子中 有40个是稀有密码子，其中Arg的密码子就有28个，这样做表达应该会很困难。但只有一个地方连续出现3个稀有密码子，应该问题不大吧。还有我的菌是Rosseta gami已经补充了一些稀有密码子。希望我到后续的表达中能顺利点，也好跟你们多点交流！