我这两个月做了两次5’RACE，都是用的TaKaRa的5'-Full RACE Kit，预测的目的带应该是700bp左右，inner PCR之后，电泳显示，果然出现了700bp的一条带，但很弱，于是用inner的条件做了2次PCR，结果得到很亮的一条700bp的带，可杂带也出现了，且背景较重，我割胶回收700bp的片段，连到pMD18-T，转化到感受态细胞中，蓝白斑筛选阳性克隆，菌落PCR后选较好的测序。可两次结果都是非目的片段（结果中有我的设计的GSP引物和试剂盒里的inner primer，但和我已经做出的中间区连接不上，blast结果也显示没有相似的序列），RNA的质量不错，之前已经成功扩增该序列的3'端。导师建议我重新设计引物，我也在试着重新设计，但怎么才能特异性高呢？也许是在别的环节上出了问题，问了好多人也不知道怎么弄，导师要我在8月之前把实验做出来，发文章，着急！！！！希望得到高人指点！！！谢谢了！orz！

可以先试着改变一下PCR的条件，我也是扩增出序列的3'端，扩增不出来5‘端，导师建议先改变PCR条件，比如说退火温度，延伸时间，估计你的很亮的一条700bp的带并不是目的条带，或者看看是不是Primer 的问题，要是Primer 的问题就要好好考虑一下了。

可以重新设计引物，跨内含子，避免基因组DNA扩增。还有就是可能非特异性条带正好你的预期的片段大小差不多，跑到一片去了，你连接都连接上了，但是你运气不好没有挑到。你可以多挑几个菌落，将菌落pcr产物直接拿去测序，说不定里面有你要的片段。也请问你一下，你takara的5‘race 试剂盒还好用吗？你订购的规格和价格是多少啊？谢谢了

[ 本帖最后由 yachong1582 于 08-5-29 19:55 编辑 ]

TaKaRa 的5‘RACE是2800元，10 reactions，还可以吧，效果一般，有条件的话，最好用clontech或者progema的试剂盒，据说比宝生物的好用。宝生物的这个试剂盒的特点是超级麻烦，费时费力，但是原理简单。总的来说，不建议你使用。