已经获得中间片段，怎么扩增上下游片段？
现在我要扩增一个基因，而该物种这个基因序列是未知的，通过同源序列比较，设计兼并引物已经获得了731bp（总长为1092bp），想请教各位达人怎么扩增上下游的未知序列？我现在的操作是这样的：
1.限制酶部分酶切总DNA
2.酶切产物加热失活（也试过纯化回收）
3.酶切产物与含有相应限制酶粘性末端的接头T4连接酶16度连接；
4.连接产物作为模板，接头中的一条单链match（见附件）为引物之一，另外一条引物为根据已获得的731bp设计的P2去扩增上游序列（扩增下游用引物match，P3）,进行PCR
可是不管怎么做，已经试过四种限制酶，也摸索过pcr的条件，可还是没有任何条带，想请教哪位高人知道我的实验到底是哪一步出了问题？还有除了RACE，反向PCR还有什么办法扩增全长序列，因为小实验室老板舍不得买RACE的试剂盒，愁死了
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