我最近遇到一个奇怪的现象，拿到这里大家来讨论一下：我把我的目的DNA（1000bp）连接到载体PMD 18-T（2692bp），经转化大肠杆菌DH5a，然后提取质粒DNA，电泳后发现在条带在2500bp以下，比载体本身的条带还小，从电泳结果可以说明我没有克隆成功。
       但是进一步我用质粒作为模板，用扩增出我的目的条带的引物作为引物，进行PCR鉴定，电泳结果显示条带在1000bp，说明质粒中有我的目的DNA，这究竟是怎么回事呢？？？
       为什么质粒的电泳结果比载体还小？？但是PCR鉴定显示载体里有我的目的DNA？？？

会不会是你的目的基因转入质粒后又转入了菌体的基因组中啊？质粒仍然不带目的基因。

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原帖由 hyde 于 08-5-12 15:54 发表
会不会是你的目的基因转入质粒后又转入了菌体的基因组中啊？质粒仍然不带目的基因。

质粒如果不带我的目的基因的话我PCR鉴定应该是阴性的，也就是没有条带，但是我PCR鉴定的结果显示出我的目的条带。

你提取的质粒电泳，最前面的条带是超螺旋的质粒，当然要跑的很快了。2500的质粒，可以跑至1500处。

要知道，PMD18T载体是线性的，电泳后条带显示在哪，那就是它真实的大小（约2600多）但是，你将目的DNA连上之后，载体就变成环状的了，电泳后会有三条带显现出来，最下面的是超螺旋，上面一点是解螺旋，最上面的是开环结果的质粒，有三条带主要是因为电泳时的凝胶的剪切作用使质粒解螺旋。这么说LZ 应该能明白了把，还有，质粒PCR有目的带初步说明连上了，你可以做酶切鉴定，并测序鉴定。祝成功！

补充：由于质粒的超螺旋结构，体积相对较小，凝胶分离的原理又是分子筛作用，所以体积较小的当然会跑的快，在下面很多

赞一下LZ，其实不是很多人都能提到这么好的质粒，只有一条超螺旋带，不过需要好好看基础书，否则为了这个小问题卡了壳就不值得了

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原帖由 nano 于 08-5-12 21:20 发表
赞一下LZ，其实不是很多人都能提到这么好的质粒，只有一条超螺旋带，不过需要好好看基础书，否则为了这个小问题卡了壳就不值得了

呵呵，什么意思啊，楼上说“其实不是很多人都能提到这么好的质粒”是什么意思啊，难道说在实验中要提到我这样的质粒是件很难的事情吗？？楼上能不能好好解释一下呢？？
      关键是我提取的质粒跑出来就一个条带，没有出现其他的条带呀！！

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原帖由 shuanhu2007 于 08-5-12 18:49 发表
要知道，PMD18T载体是线性的，电泳后条带显示在哪，那就是它真实的大小（约2600多）但是，你将目的DNA连上之后，载体就变成环状的了，电泳后会有三条带显现出来，最下面的是超螺旋，上面一点是解螺旋，最上面的是开环结果的质粒，有三条带主 ...

关键是我提取的质粒跑出来就一个条带，没有出现两条带，更没有出现楼上所说的三条条带，这是怎么回事呢？？！

跑胶的时间长一些，就有可能分出三条带了。一般提取质粒的时候不可避免的要造成质粒的开环。