关于稳定转染真核细胞的鉴定（即外源基因在真核细胞的表达）——
一些个人体会（转载）
真核细胞稳定转染的实验周期较长，从构建载体、转染、筛选单克隆、扩大培养直到鉴定，加起来个把月的时间就扔进去了。而且更重要的是后续实验的延续性，只有对转染细胞的质量进行严格控制，才能满足实验的需要。因此，对转染细胞的鉴定是很慎重的问题，常用的方法有：
1. Western blot(蛋白水平，首选)
利用Western blot技术，对转染后细胞内是否有目的蛋白X的表达进行检测。这里，需要设置好阴性对照和阳性对照。举例说明：例如，我的载体里面有HIS-tag标记，那我就可以用HIS-tag抗体检测细胞中目的融合蛋白X－HIS的表达情况。当然，如果手里有针对目的蛋白X的抗体那就更方便了，直接用它就可以了。
阴性对照：稳定转染空载体的细胞的裂解液
阳性对照：表达X蛋白的细胞；或者体外表达X蛋白的大肠杆菌的菌体裂解液
在进行SDS-PAGE的时候，将实验组，阴性对照，阳性对照同时在一板胶上电泳，然后转印、杂交、显影。最理想的结果是：阴性对照无带；而实验组和阳性对照出现与目的蛋白X分子量相近的条带，且二者位置相当（当然，如果检测的是融合蛋白，则融合蛋白分子量＝目的蛋白X的分子量＋Tag的分子量）。
2. RT-PCR（mRNA水平）
通过RT-PCR检测目的基因X的转录情况。在进行扩增时要注意设置阴性对照和阳性对照。
阴性对照：RT反应时，将反转录酶用ddH2O代替，其余成分同实验管，同时进行反转录反应后，用PCR反应观察能否扩增得到目的片段。
阳性对照：以表达该目的基因X的细胞作为RT反应的RNA来源，同法进行RT-PCR；或者以含有目的基因片段的质粒DNA作为PCR模板，进行PCR反应。
在将PCR产物进行电泳的时候，将实验组，阴性对照，阳性对照同时在一板胶上电泳，最理想的结果是：阴性对照无带；而实验组和阳性对照有相应大小的DNA片段出现，且二者位置相当。
但是，切记鉴定实验不是就此结束了，还有一个重要的实验：测序！！如果不经过测序的验证就直接下结论说细胞里有X基因的表达，未免有些武断。（个人的感觉是：RT-PCR的结果若不经测序验证，心中惴惴不已，何谈信心去做下一步实验。）
3. 其他
如原位杂交，免疫荧光，免疫细胞化学，活细胞GFP观察等则见仁见智，各位酷友可以在文献中search看看！
基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电穿孔等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验（即瞬时转染）。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。筛选后可以得到稳定表达外源基因的细胞克隆，这就是稳定转染。
稳定转染和瞬时转染的区别就是在转染后是否用药物筛选。
我常采用的方法是RT-PCR鉴定目的基因的mRNA，然后进行间接免疫荧光鉴定，最后是WB，一般经过这3步基本上可以明确稳定转染的成功与否。
此外还需注意几点：
1，采用RTPCR法鉴定的时候，最好用DNA酶处理一下提取的RNA然后再进行RT－PCR，以避免残留的质粒或其他污染。
2，采用WB的时候需要注意，如果表达水平一般不是很好，采用HRP-DAB或者HRP-TMB系统，其检测灵敏度在100pg以下，可能不能满足你用来检测真核细胞蛋白表达检测的需要，建议采用灵敏度更高的化学发光WB检测。
