各位大侠,最近我一直都在做PCR,可是总得不到目的基因,请大家帮我分析一下原因,谢谢!
   我的基因是PCNA(增殖细胞核抗原),ORF为78 3bp,设计引物为:
上游引物:  CGGGATCCATGTTTGAGGCACGTTTA（BamHI）GC%: 50%  Tm=63.57
下游引物： CCGCTCGAGTCAGCTGTCTTCTTCCT（Xho1）GC%:57.7% Tm=66.72
我以我们实验室的cDNA为摸板,采用下面的体系(25微升):
ddH2O :18.5  
10Xbuffer 2.5
cDNA    0.5
dNTP   0.5
pre上/下 1.0
Taq 酶: 0.5
预变性:94度,10分钟,变性:94,1分钟,退火温度用过51度,40度,延伸温度为72度,1分钟,最后延伸72度,10分钟,
结果怎么都出不来,我们实验室同学都表达了蛋白,我才刚开始,急死了,请大家帮帮忙.

你的cDNA质量能够保证吗？一般PCR扩不出来，首先要考虑模板的问题。cDNA浓度是多少，含量如何等等。如果模板没问题，再看你的引物是否特异性比较好。你没有获得条带，是一点东西都没有还是没有目的条带？

CDNA是我们实验室自己制备的,具体的浓度我不太清楚.同组同学用这个模板做出来了,我的上下游引物各有15个碱基与模板配对，但是我两次都没有得到任何条带。

做一个阳性对照吧

15个碱基有些短，你可以考察一下不同酶体系，不同的taq酶扩增还是有很大差别的。如果模板和引物没有问题，就更换酶体系吧，或者试试touchdown，看有没有条带。

上面说错了，我的上下有游引物游17个碱基配对。
我今天用了其他同学的cDNA 和Taq酶,引物用自己的；同时用同学的引物，用我的cDNA 和Taq酶,dNTP增加到1微升,其他条件不变，退火温度用40度，还是一无所获，我都不知道该从哪里找原因了。

你的引物和同学的引物都没有扩出东西吗？以前你同学是可以扩出来的吗？你和同学的cDNA有区别吗？如果没有，就应该是你程序的问题了。

是的，我们两个的都没有批出来，以前她是可以批出来的，
我用他们组的cDNA,她的那管用我们组的。
我现在用了总DNA，同学组的cDNA和Taq酶，分别用我的同学的引物来批，不知道结果如何人，谢谢各位了。

欢迎以后常来讨论啊！大家共同进步！祝你好运

[ 本帖最后由 hyde 于 08-4-30 20:48 编辑 ]

谢谢版主！ 昨天去看了场电影，回来满心期待终于可以批出来了，可是，事与愿违，还是啥都没有，我寻思是不是我好久不做试验，技术下降，今天让同学代劳，重做一遍，依然期待结果。