大家好,我现在有两个基因需要表达,一个是分泌性蛋白,一个是非分泌性蛋白.现在准备在毕赤酵母中进行表达,看了相关文献,自身为分泌性蛋白的基因在PPIC9K中进行表达时,插入的是编码成熟肽蛋白的核苷酸序列(即去掉信号肽的CDNA序列,但我的信号肽本身就是通过软件预测的,怕直接冒失的去掉,会在毕赤酵母中表达时没有活性,但不知道为什么不能直接把整个CDNA插进PPIC9K进行表达呢,而且像这样的情况想直接找编码成熟蛋白序列应当怎么办?):还有另一个基因是编码非分泌性蛋白的,这种基因是不是可以直接把整个CNDA全长转入PPIC9K进行表达呢?谢谢各位了,

关于前者，最佳的信号肽确定方法就是成熟蛋白N端氨基酸测序，从而确定信号肽的准确位置。直接将整个cDNA插入pPIC9k表达载体也是可以的。
后者同样，胞内表达需要删除你的信号肽序列，否则可能会造成蛋白的分泌。

请问成熟蛋白N端氨基酸测序如何完成,是否必须要分离到表达的蛋白?

还有,我和我老板商量了一下,他说分泌性的蛋白,要做真核表达(PPIC9K),只要在ATG之后任意找一个核苷酸(离ATG不要太远),但要是处于三联密码子的第一位,即可以表达,不知他说的对不对呀,我们老板以前也没做过这方面的东西,
我想如果从ATG后的任意核苷酸(三联密码子的第一位)插入载体,最后表达的蛋白不是比真正的要表达的蛋白在N端多不少氨基酸吗?这种情况会不会最后使蛋白没有活性呢?
麻烦各位了

分泌表达和包内表达建议用两个载体，分泌用9k，包内用包内载体。

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