直接免疫荧光法鉴别B淋巴细胞膜表面免疫球蛋白（SmIg）

  一、实验原理
SmIg是B细胞的抗原识别受体，也是B细胞特异的表面标志，用直接免疫荧光法可检查出SmIg鉴定B淋巴细胞。用荧光素标记的抗Ig抗体，在一定条件下与淋巴细胞混合，荧光素标记的抗Ig抗体可以与B细胞表面的Ig结合，在荧光显微镜下观察可见B细胞膜上出现荧光。

二、实验材料
1.    ICR小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）
2.    异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗小鼠Ig抗体（购自BD公司）
3.    Hank’s液：pH7.4(内含0.1%NaN3)
4.    台式离心机
5.    离心管、吸管、移液管等

三、实验方法
1．采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出脾脏放入盛有6ml Hank’s液的平皿中，用100目钢网研磨，混匀。从中吸取1ml细胞悬液放入一试管中，加满Hank’s液，离心1000rpm，10分钟，洗涤细胞一遍。倾去上清，沉积的细胞恢复1ml容积，即为约1×107/ml的细胞悬液。另取一支试管，吸取1×107/ml的细胞悬液0.4ml加Hank’s液3.6ml，即为1×106/ml的细胞悬液。
2．取2ml离心管两只，各加入1×106/ml的细胞悬液1ml，用台式离心机离心2000rpm，3分钟，弃去上清液。一支加入荧光素标记的兔抗鼠Ig抗体100μl，另一支不加抗体作对照，置4℃冰箱30分钟。
3．取出离心管，用Hank’s液洗涤细胞两次，以去除游离的抗体，最后一次离心后弃去上清液，留少许回流液，混匀，滴片，用荧光显微镜观察。

四、实验结果
荧光显微镜观察，落射激发光下SmIg阳性细胞可见环状或斑点状荧光。用钨丝灯光源透射光照明计数同一视野内淋巴细胞总数，共计数200～300个淋巴细胞，算出其中SmIg阳性细胞的百分数。

五、注意事项                                                      
  在滴片前要彻底去除游离的抗体，以避免假阳性结果。

石蜡切片免疫组化染色步骤  1、载玻片的处理：
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：
2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
  2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3、抗原热修复：
  可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0  0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
  3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
4、免疫组化染色步骤：
  （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
  石蜡切片脱蜡至水。
  3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
  蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
  5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
  PBS冲洗，5分钟×3次。
  滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
  PBS冲洗，5分钟×3次。
  滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
  PBS冲洗，5分钟×3次。
  显色剂显色（DAB或AEC）。
  自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片4~8m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。

免疫组化非特异性染色的消除方法  一、非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。
二、消除非特异性染色的方法
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
（一）动物脏器粉末吸收法
常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min
10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
（二）透析法
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
（四）DEAE纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜
。常用梯度洗脱法如下：
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，
分别洗脱和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至
2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制备　　在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
2．免疫吸收法　　将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以
和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
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免疫组化非特异性背景染色及其控制方法  一、非特异性染色的识别
常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。
二、非特异性染色的原因
1. Ig与Fc受体结合
多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。
避免方法：
① 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片；
② 用不含Fc段的抗体，但价格贵
（V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化）

2．静电吸附
抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。

避免方法：
① 尽量稀释一抗
② 降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；
③ 用去垢剂 如triton-100处理切片。 Tween-20等；

3.二抗与组织中的Ig结合
如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越
明显，如人与猴，兔与豚鼠。
避免方法：用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。

4．组织中残存醛基与Ig的结合
如醛类固定后未能彻底的冲洗，残流醛基可以和Ig结合。
避免方法：
①彻底冲洗；
② 0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗；

5．内源性过氧化物酶
红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。
避免方法：
① 石蜡切片 0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片；
② 冰冻切片 3%双氧水处理切片5分钟（99：1）因为未经固定包埋，大部分酶未被破坏；
③ 对于骨髓涂片
最好用非过氧化物酶标记的抗体
如碱性磷酸酶（AP）
↓
磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料
↓
快兰(fast blue)或快红(fast red)
↓ ↓
兰色 红色
用明胶甘油封片，不能用含二甲苯的封片剂，溶于二甲苯。

6. 内源性生物素
以 24mg/ml的卵白素封片15分钟；
7. 交叉反应
PcAb敏感性高，但特异性稍低，容易出现非特异性染色。
避免方法：
①尽可能稀释抗体；
②尽可能用McAb;

三、 抗体最大稀释度的求法
最大稀释度的目的：
1.节约、
2.特异性染色↑、非特异性染色↓（决定其最大稀释度）
棋盘法
如 稀释度
1：50 1；100 1：150 1；200
特异性染色 +++ ++ ++ +
非特异性染色 ++ + - -

免疫组化常见问题的处理  当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
   ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
   ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
   ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
   ④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
   ⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
   ⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
   ⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
   ⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
   ⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

弱阳性
   如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
   ① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
   ② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
   ③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
   ④ 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
   ⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。

非特异性染色
   ① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为： 灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
   ② 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
   ③ 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
   ④ 一抗的使用浓度是否过高。
   ⑤ 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
   ⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
   ⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
   ⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。

免疫组化实验过程中的要点和技巧  1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。


Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。

PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存

6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。

8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

14．在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。

免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策  良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
一、 无色片
染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。
抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。
二、“杂音”染色片
免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。
1、 全片着色
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：
（1）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4篊冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
2、 切片边缘着色
切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因：（1）、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。（2）、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4 mm。
3、“阴阳脸”着色
指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。有时，用DAKO（或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
4、 灶片状着色
切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：（1）、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不能平放，应有45度左右的斜度，利于水流走和蒸发。（2）、坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc段）可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。（3）、制作APES胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行，即5%盐酸酒精（5ml盐酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥（室温）、2%APES（2 ml APES+98 ml丙酮）浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮（1-2秒钟）、玻片过一下蒸馏水（1-2秒钟）、37°C过夜干燥、室温储存备用。如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。
5、 间质着色
着色部位主要在间质，间质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是lambda和kappa染色时。当甲状腺胶质外溢到组织间质时，做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色，我们曾遇到CD20抗体不纯，除了染上B细胞外还染上了间质。
6、 细胞浆着色
胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白（红细胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，我们研究结果显示：冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性（+）到强阳性（+++），内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织，内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA，热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer两步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干扰。
7、 细胞核着色
不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯里浸泡时间太长（如从星期五浸泡到下星期一）、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少，未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。

免疫PCR (Immuno PCR, Im-PCR)（转贴）  一、定义；
  免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。
  用抗体检测抗原是免疫学的最基本方法，用酶或同位素标记抗体可使检测的敏感性提高，常用的定量检测方法ELISA和RIA均基于标记分子可以使检测的信号增强。免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
二、基本原理：
  免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素(Protein A-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA) (Biotin-pUC19)中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。
PCR由 ①待测抗原；②生物素化抗体；③亲和素（连接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR扩增五部分构成。
1 待检抗原
被检测的样品可以是抗原，或者是作为抗原的某种抗体。待检的抗原可以直接吸附于固相，这一过程与ELISA试验是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能应用目前介绍的免疫PCR方法进行检测，需要对免疫PCR进行改进，以便能够检测吸附性差的抗原。免疫PCR的后续过程需PCR扩增，目前有些方法应用的固相板或管是特殊用于免疫PCR，并且有些PCR仅可以直接用微量板进行扩增，这样可以简化实验过程和提高检测的精确性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特别适用于检测微量抗原。
2 特异抗体
  免疫PCR中的特异抗体是对应于待检抗原，与ELISA一样，抗体的特异性和亲合力将影响免疫PCR的特异性和敏感性。一般均选用单克隆抗体，这个抗体常采用生物素标记，通过亲和素再结合DNA。
3 连接分子
  连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。目前介绍的方法中均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA连接，生物素和亲和素作为免疫PCR的连接分子在连接方式上有许多差异。Sano首次报道PCR时用的是重组葡萄球菌A蛋白-亲和素嵌合蛋白(SPA-亲和素)。其具有结合IgG和生物素的两个位点，因此可以将IgG与生物素化的DNA连接成复合物。由于重组的SPA-亲和素没有商品试剂，且SPA不但可以结合特异抗体的IgG，而且还可以与样品中吸附于固相的无关IgG结合，特别是检测的抗原就是某种IgG，因此，Ruzicke认为Sano的免疫PCR本底高和特异性差。Ruzicke用商品化的亲和素系统试剂建立了一种免疫PCR，这种方法是先将亲和素与生物素化的DNA预结合成复合物，然后再与结合固相的特异性抗体结合，这种方法存在的问题是亲和素与生物素化的DNA分子预结合时二者的分子比例并不是等同的，一个亲和素分子可以结合4个分子生物素，因此在预结合时生物素化的DNA分子不能过多，否则DNA分子上的生物素将亲和素完全饱和，亲和素再无结合生物素化抗体的能力;但在低饱和生物素化DNA时，亲和素结合的生物素化DNA存在许多种类的复合物，甚至还有游离的亲和素，只有部分结合生物素化DNA的亲和素才能起到连接分子的作用，因此，这样预结合的亲和素和生物素化DNA是一均质性很差的混合物。虽然预结合的复合物可以减少测试过程中的1次孵育和冲洗，但是这样的复合物作为连接分子必然导致敏感性低和误差大，并且每次制备的连接分子均有差异，从而导致重复性差。
Hong zhou等建立了一种免疫PCR方法，连接分子是链亲和素，在连接抗体和DNA时是以游离的方式加入，这样链亲和素先与生物素化抗体结合，冲洗后，再加入生物素化的DNA。这个方法虽然多了1次孵育和冲洗过程，但具有较好的敏感性和重复性。
4 DNA和PCR系统
  免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是应用了PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA的纯度，且有较好的均质性，尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。一般可选用质粒DNA或PCR产物等。DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过DNA聚合酶标记在DNA分子上，一般是一个分子DNA标记两个生物素，标记率可达百分之百。生物素化的DNA用量需预先选定，过多易出现非特异结合而引起本底过高，过低将导致敏感性低和出现不同浓度抗原得出同样结果的饱和现象。
免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相进行抗原抗体反应，同时又需要对固相结合的DNA进行扩增，因此，免疫PCR固相的选择应根据具体情况确定。用微量板作为固相必须有配套的PCR仪，以使可以用微量板直接扩增，否则需要用PCR反应管作为固相扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据PCR产物的大小选择两种凝胶的浓度。电泳后凝胶经染色和拍照记录结果，再检测底片上PCR产物的光密度，并与标准品比较就可以得出待检抗原量。
三、主要程序
（一）抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；
（二）加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；
（三）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；
（四）PCR扩增生物素化DNA部分。
四、制作方法
（一）制备生物素化DNA
  将噬粒 BLuescript skt，用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNA片段，即为生物素化DNA。
（二）免疫PCR模式
1 试剂
包被缓冲液:20mmol/L Tris-HCI(pH9.5)，含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗涤液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀释液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA (0.1mg/ml)
2 操作
1)包被
用包被缓冲液稀释抗原(BSA)，加入微滴板中(45μl孔)，4℃过夜(约15h)，用洗涤液洗板3次×5min。
2)封闭:
每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA(1mg/ml)、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min，洗板数次。
3)抗原抗体反应:
用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温(～22℃)下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。
4)链亲合一蛋白A结合反应:
每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温(～22℃)50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。
5)PCR
实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2、明胶(10μg/ml)、0.8mmol/LdNTPs(每种0.2mM)、2μM引物(每一引物1μM)和TaqDNA多聚酶(50U/ml)。
PCR周期 PCR前，用紫外线(UV)(254nm)照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期:起始变性94℃5min;30个周期:变性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR产物为特定的261bp的片段。
参考流程
1. 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度。
2. 加50μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔内）。  
3. 用400μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次。
4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清(NGS) PBS封闭2小时.
5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.
6. 加入100μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体(内含100μg的鲜鱼精DNA),室温孵育30min.
7. 用TPBS洗涤五次.  
8. 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体,室温孵育30min.
9. 用TPBS洗涤五次.  
10.加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素,室温孵育30min.
11.用TPBS洗涤五次,再用HPLC级水洗三次.  
12.PCR扩增:加入50μl PCR反应液(内含T3和T7引物),95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec,循环30次.取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳,和核酸分子量标准相比较,在相应的位置邮现电泳带为阳性.必需时将电泳结果照像,进行定量分析.  
3 PCR产物的检测与定量技术
1）凝胶检测系统 用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量，放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定，最近用自动DNA测序仪检测荧光标记的核酸，这种方法可准确测量扩增产物的大小，而且其检测灵敏度达fg水平，但由于自动DNA序列仪和荧光标记引物极为昂贵，所以现在仅用于研究。
2）HPLC检测系统 此法的优点为PCR产物不用纯化，对未标记的产物灵敏度可达fg水平，对标记产物的检测限度可能更低。HPLC能区分不同分子的大小，可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。
3） 固相测定系统 最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用仪器比色或读数，可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板，此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量，如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量，将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2。定量方方法为:双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物，然后加至亲合素包被的微量滴定板上温育至少2小时，洗涤数次后，与DIG抗体:AP结合物温育，根据其底物不同可产生不同的颜色，亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵活和容易操作的技术，将成为定量PCR的一个关键技术。
4）SPA(Scintillation Proximity Assay)系统 用亲合素包被的氟微球作为固相载体，用生物素标记引物，在扩增时掺入氟化的核苷酸，扩增完成后，加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR产物，此捕获过程可使与氟微球紧密结合，氟被氘激发产生光脉冲，可用闪烁计数仪测量。与比色法相比，此法具有更大的线性范围。
5）点杂交检测系统 将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面，与标记的DNA探针杂交，亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T)尾巴固定于膜上，与变性后的已标记的扩增产物杂交，在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面，故其反应动力学接近于液相，反应速度快，通常使用生物素化的探针或扩增产物，用亲合素-AP结合物产生颜色斑点，通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。
6） 电化学发光检测系统 通过亲合素-生物素系统将扩增产物结合于磁性珠，然后与2，2'-联吡啶-钌螯合物(TBR)标记的探针杂交，加入三丙胺(tripropylamine，TPA)溶液，并转移至电化学发光仪的检测池，当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化，TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质，可与氧化的TBR反应，使之进入激发态，当由激发态变为基态时可发射出620nm的光，发光强度与TBR标记物的量成正比，通过发光强度对PCR产物定量，此法的敏感性为amol水平，可自动化测量。
7） DNA酶免疫测定系统 通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合、再通过酶第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记，但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。
8） 激光诱导荧光检测法 首先用荧光标记物FAM(商品名)的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨已基连接臂偶联于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR扩增，用毛细管电泳扩增产物，最后用氩离子激光光原检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少，可自动化检测，快速、灵敏和高分辨率。
  总之，可用上述方法对靶基因定量，其准确性可通过复管测定和利用内标使数据标准化而得到提高。由于亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术具有有效、灵活和容易操作等特点，有较好的临床应用前景。定量PCR仍然存在技术上的问题，目前多用于研究，但在肿瘤、细菌、真菌和病毒性疾病的诊断和治疗方面对此技术的需求将日益增加。
五、免疫PCR的应用和发展
   免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，还没有一个十分成熟和满意的方法，配套试剂尚缺乏，所以应用的还不多，在报道的几种方法中均是用一些已知的标准品进行试验。Sano，Ruzicka和Hong zhou分别用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重组人原癌基因产物ETS;蛋白作为待检抗原进行免疫PCR，他们的结果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。目前介绍的免疫PCR还存在一些缺点，在报道的文献中均采用待检抗原直接吸附固相，这样固相的均质性必然对结果有很大的影响;同时检测的样品液中其它成分也可以吸咐固相，极易产生背景过高或精确度下降。另外，有些难于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR检测，连接分子的特异性和均质性对PCR影响很大，从理论上看Hong zhou的生物素标记抗体和DNA以及用游离的链亲和素连接抗体和DNA是一比较理想的方法，但是如能做到生物素化抗体、亲和素和生物素化DNA3个分子预先连接一个复合物，那么将简化实验过程。PCR扩增过程相对简单，如用微量板作为固相需选用配套的PCR仪，否则需将其移入反应管内，这必然导致很大的误差，经放大可产生显著差异。固相也可以直接采用某些PCR反应管，并且可以直接用一般的PCR仪进行扩增，但冲洗过程相对复杂一些。免疫