引用:

原帖由 need_cloth 于 08-4-1 22:50 发表
谢谢你的帮忙！

如果确定是移码突变的只有重新构建了吧？如果是重新构建的话在构建的时候要注意哪些方面(在减少移码突变方面）！

重复过试验以后才能确定到底是啥出问题，到底是你的试剂、诱导条件、还是菌株抑或质粒。论坛上只能根据你的描述大致说下可能问题，具体还是要靠试验来确诊的。


还有就是既然别人的能用……你就用他们的就可以了阿，重整载体属于吃力不讨好的活……

重构建，就是一定要用高保真酶，做出来以后多挑几个克隆去测序。还有如果你的序列只是一个突变，也可以用高保真酶，在那个位点作点突变。


不过我建议你不是自己构建的质粒，如果要用的话，特别是做表达的，一定要测序，就算是好用的，也要测，如果送你质粒的人，没给你测序文件的话。

[ 本帖最后由 tangboyun 于 08-4-1 23:26 编辑 ]

可能是你的表达载体不好，用PET-32a表达比较好，我用过

现在还在测序中，只回来一个循环！等待中....

如何判断测序结果？

测序结果出来了！

下面是测序的结果
1      TTT TGG AGG GGT AAT CAT TTC CCT CTT AGA
31     ATT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT
61     ATA CCA TGG GCA GAA GCC ATC ATC ATC ATC
91     ATC ACA GCA GCG GCC TGG TGC CGC GCG GCA
121    GCC ATA TGG CTA GCA TGA CTG GTG GAC AGC
151    AAA TGG GTC GCG GAT CCG AAT TCA TGA AAA
181    GAT CAA AAC GAT TTG CAG TAC TGG CCC AGC
211    ACC CCG TCA ATC AGG ACG GGC TGA TTG GCG
241    AGT GGC CTG AAG AGG GGC TGA TCG CCA TGG
271    ACA GCC CCT TTG ACC CGG TCT CTT CAG TAA
301    AAG TGG ACA ACG GTC TGA TCG TCG AGC TGG
331    ACG GCA AAC GCC GGG ACC AGT TTG ACA TGA
361    TCG ACC GGT TTA TCG CCG ATT ACG CGA TCA
391    ACG TTG AGC GCA CAG AGC AGG CAA TGC GCC
421    TGG AGG CGG TGG AAA TAG CCC GCA TGC TGG
451    TGG ATA TTC ACG TCA GCC GGG AGG AGA TCA
481    TTG CCA TCA CTA CCG CCA TCA CGC CGG CCA
511    AAG CGG TCG AGG TGA TGG CGC AGA TGA ACG
541    TGG TGG AGA TGA TGA TGG CGC TGC AGA AGA
571    TGC GTG CCC GCC GGA CCC CCT CCA ACC AGT
601    GCC ACG TCA CCA ATC TCA AAG ATA ATC CGG
631    TGC AGA TTG CCG CTG ACG CCG CCG AGG CCG
661    GGA TCC GCG GCT TCT CAG AAC AGG AGA CCA
691    CGG TCG GTA TCG CGC GCT ACG CGC CGT TTA
721    ACG CCC TGG CGC TGT TGG TCG GTT CGC AGT
751    CCG GCC GCC CCG GCG TGT CGA CGC AGT GCT
781    CGG TGG AAG AGG CCA CCG AGC TGG AGC TGG
811    GCA TGC GTG GCT TAA CCA GCT ACG CCG AGA
841    CGG TGT CGG TCT ACG GCA CGG AAG CGG TAT
871    TTA CCG ACG GCG ATG ATA CGC CGT GGT CAA
901    AGG CGT TCC TCG CCT CGG CCT ACG CCT CCC
931    GCG GGT TGA AAT GCG CTA CAC CTT CCG GCA
961    CCG GGA TCC GAA GCG CTG ATG GGC TAT TCG
991    GAG AGC AAG TCG ATG CTC TAC TCG AAT CGC
1021   GCT GCA TCT CAT ACA AAG CGC CGG GGT TCA
1051   AGG CTG CAA ACG CCC GTG AGC TGT ATC GGC
1081   ATG ACG GGC CTT GTG CGT CGG GTA TTC GGC
1111   GGT GCT GGC GAA ACC TGA ATC GCC TCT ATG
1141   CTC GCA CTC GAA TGG CTT CGC CAC GAA CCG
1171   ACT TCA TCG GAA TTG CGT ACG TGC ACT TGT
1201   ATG CAA GTG CTG TCC

我插入的是经过EcoR 1酶切的，位置是168，GAATTC 帮我看一下有没有移码突变

我想问一下有关使用PET28a(+)载体做表达时,我要表达的序列是一段部分序列,没有起始密码子,那在设计引物时在5'端用加起始密码子ATG,我看了PET28a(+)载体使用说明上说以"a"为结尾命名的载体的起始密码子用GGA,我现在不知道该用哪个了?还有就是PET28a(+)载体做原核表达时的能承载的最好表达量大约是多少

你的表达条件还有继续优化的空间。你可以优化温度（37、30、25 ），诱导物浓度（1、0.5 、0.1），表达时间，还可以选择融合蛋白标签（比如gst），优化基因密码子使用以符合大肠杆菌密码子使用偏好，使用其他宿主菌（BL21pLysS、Origami B），添加100mM氯化镁等（这个有文献报道可以提高表达，不过是针对特定的蛋白和宿主，原理不清楚）

下面给你几个文献信息，你可以查一下。（文献太大我无法用附件粘贴）

A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon a as a GST-fusion protein in E.coli
Imen Rabhi-Essafi, Amine Sadok, Noureddine Khalaf,and Dahmani M. Fathallah1

Improved production of recombinant fibroblast growth factor 7 (FGF7/KGF) from bacteria in high magnesium chloride
Yongde Luo,Hyun-Hee Cho,Richard B. Jones, Chengliu Jin, and Wallace L. McKeehan