最近做实验遇到了些问题，是关于大肠杆菌表达的，前期课题组构建了一大肠杆菌基因工程菌，表达量上不去，可溶性蛋白的量少的很，我分别用诱导温度，诱导剂浓度和诱导时间来优化，量还是没上去，我借用了其他课题组构建的工程菌来测试，他们的表达量却好高，由于第一次做诱导方面的工作，所以不知道哪里出问题了。看了些论坛的资料，自己猜测了些可能存在的问题


表达量差不多是20ml的培养基离心取沉淀，用20ml磷酸缓冲液重悬，超声破碎。用考马式法测定可溶性蛋白浓度大概在0.5mg/ml左右，请问一下高通量表达蛋白的浓度应该是多少。实验室用的质粒是pet-28a。需要表达的酶序列为3000bp左右！

我想问一下大侠们，可能存在的问题是在哪里？如何来验证？

[ 本帖最后由 need_cloth 于 08-3-29 22:38 编辑 ]

“用了其他课题组构建的工程菌来测试，他们的表达量却好高”
他们的菌株、质粒和你用的是一样的么？他们表达的蛋白也是一样的么？

你的菌是新转化的？还是冻存保存了很久？有没有提质粒重转化，重新涂板，重新挑单菌再来测试？表达的蛋白分子量正确么？

如果以上一切都没问题，可能你的蛋白本身表达确实是会比较低，毕竟是个110kd左右的蛋白了，还是可溶。

0.5mg/ml是总蛋白还是目的蛋白？目的蛋白的话，不错了，还可以了。如果是总蛋白的话，你开始诱导前，OD600多少？

要再提高产量可以考虑自动诱导培养基。http://www.genecool.com/bbs/thread-118-1-1.html

[ 本帖最后由 tangboyun 于 08-3-29 23:48 编辑 ]

谢谢你的帮忙！

菌是前期课题组构建的，其他课题组构建的表达的酶和我的是一样的，但是表达量却比我高好多，0.5mg/ml 是总蛋白不是目的蛋白，开始诱导前OD600为0.6，诱导温度26度，iptg为1.0，时间5h。

我想问一下可能存在的问题是在质粒身上还是在表达系统上？

0.5mg/ml 是总蛋白的话，好像很低阿，你摇了以后菌变少了么。还是有许多蛋白形成了包涵体？看下不溶性的沉淀里，是不是有大量你的蛋白，如果是形成包涵体，你可能要优化表达条件。

菌的话，重新划板看看，挑一个大些的菌落再诱导试试看。

你借用“其他课题组构建的工程菌”，质粒构建的都一样么？菌株也一样么?不放心就重新测一次序。

“其他课题组构建的工程菌”，这个菌如果用的是BL21DE3，JM109DE3这种本身不带其它质粒的表达菌的话，你就把这个表达菌的质粒用普通LB抗性培养基摇一下抽提出来转DH5alpha，一起送去测。

[ 本帖最后由 tangboyun 于 08-3-30 14:42 编辑 ]

谢谢你的帮忙！
我用的大肠杆菌是E.coli BL21（DE3），培养基加kana，菌体破碎后用考马斯法测上清蛋白只有0.5mg/ml 是不是太低了？大概多少才合适？

让我郁闷的是其他课题组的诱导温度在37度都能出目的蛋白，我的26度都不行，哎～！


我试试E.coli BL21（DE3）中重提质粒转入到其他大肠杆菌中表达试试！

[ 本帖最后由 need_cloth 于 08-3-30 15:10 编辑 ]

你的破碎可能有问题，有没有破碎完全？换溶菌酶裂解看看，把菌液浓缩后，加入适量溶菌酶，等溶液变粘稠以后用超声略微震荡至不那么粘稠为止。具体如何用溶菌酶查一下相关资料。

菌体总蛋白随OD不同，也不同的，但至少该在数g至数十g每升。

我的建议：
1、你看看破碎离心以后的沉淀是不是有很多，可能破碎不完全，导致释放的蛋白少，若破碎完全，看看有无包涵体

2、若以上都无问题。测一下你的质粒，是不是有移码突变，导致阅读框无法终止，这样既检不出目的蛋白，又会造成菌体总蛋白含量降低。（因为同样的蛋白，按你所说其他人表达的很好，所以排除毒性蛋白的问题） 最简单的办法，要其他人的质粒转化后相同条件诱导一次看看结果。

[ 本帖最后由 tangboyun 于 08-3-30 15:28 编辑 ]

谢谢你的帮忙，我想破碎应该没有问题，用的是750w大功率超声破碎，500w左右超声破碎时间6分钟，总共时间11分钟左右，个人感觉菌体也不粘稠！


我同学的质粒和E.coli也和我的一样！

[ 本帖最后由 need_cloth 于 08-4-1 20:57 编辑 ]

我想问一下移码突变是怎么样的情形？

你用你同学的那个表达的很好的质粒，拿过来转化你自己的菌，用你的条件诱导次看看。
你是用超声破碎细胞的，核酸肯定破碎时候被打断的，所以不会变粘稠的，溶菌酶破碎需要打断核酸，不然液体很粘稠不利于离心。

移码突变的情况我遇到过一次，PCR拉了T载体上序列以后切了下连入载体，死活见不到表达条带，但诱导的细菌对比对照的，本身的蛋白表达下降，测序以后发现阅读框中就在引物上游有个移码突变，原先的终止密码子失效，可以通读……

[ 本帖最后由 tangboyun 于 08-4-1 21:18 编辑 ]

谢谢你的帮忙！

如果确定是移码突变的只有重新构建了吧？如果是重新构建的话在构建的时候要注意哪些方面(在减少移码突变方面）！