如题：请各位帮我看看我的RACE拼接结果，谢谢！！！！！！！！

5和3RACE做了克隆在上海生工测序，5RACE片段长度是M13双测（双测能拼接）3RACE用M13一个反应即测通

5RACE的双测结果和全长拼接均用NCBI Blast 2squence 拼接
现有三处不明，希望大家帮忙分析，谢谢！

1 拼接的全长与同源的序列用NCBI blast 2 sequence比对结果如图A: a为拼接得到的全长
长1472bp ：b为同源序列
奇怪的是两序列在3端有一段空隙（如图）
难道是我的序列3RACE序列不全（从测序的SEQ文件都能找到链接位点和3RACE特异性引物）？

2 将拼接的序列NCBI blastx结果如图B：图上似乎也表明我的氨基酸全长缺少了其他氨基酸（不知图中非红色部分即所以了这个问题 ；blastx得到的都是同源蛋白且一般在380多个氨基酸左右，而我的序列经DNAStar和NCBI ORF FINDER分析都只有333个氨基酸。结合问题1，2是否说明我所得序列的3端不全或者是即使是同源蛋白也存在氨基酸个数不同？

3 这次测序有个奇怪的现象就是在3RACE的测序结果里ployA尾中间夹非A碱基：如本序列AGAATAAAGATGAAAATGCAAGTGTTTTAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAA
另一物种同一基因的polyA尾CAGAATAAAGATGAAATTGCAAGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTGAAAAAAAAAAAAAAA

帮忙顶一下

我想要全面分析你的问题必须得到测序结果原始资料sequence 和.ab1的峰图看看到底是测序上的误判还是其他,这可以解释到ployA尾中间夹非A碱基问题和氨基酸全长缺少等问题,是否提前出现终止子而导致氨基酸减少，提前终止子是测序问题还是的确存在该基因的isoform形式问题.图中非红色并非缺少了其他氨基酸，而是对应的氨基酸相似性差异大。

kaige88版主 请你帮我再看看 我刚才按您的提示重新分析了一下，会不会因为我的3RACE只测了一个反应而导致这样的结果，但从测序末端来看，测序长度得到的长度是没有问题的，因此由测序导致终止密码子的提前出现极有可能，所以我现在决定从另一端再测一次，您看如何？谢谢您的解答让我豁然开朗！

另外请问该基因不同物种的5RACE正向测是套（正反向测即能拼接），反向测则没有套峰，但没有测通。请问这是什么原因呢？已经是第二次遇到这样的问题了，谢谢！问题太多了！

[ 本帖最后由 yf-deng 于 08-3-30 11:30 编辑 ]

不知道你扩增是何基因,在其他物种的保守性如何？从测序峰结果来看基本可信，但是不知道你是否注意到同基因“另一物种的poly尾峰图”中T和G下有A小峰出现，可以对照前基线看看，可能存在测序在重复A上错读可能性，“我拼接序列的poly尾峰图”中C下同样有T小峰，“该基因不同物种的5RACE正向测是套（正反向测即能拼接），反向测则没有套峰，但没有测通”肯定是测序上问题，可以换家公司测测，如英骏公司测的较长，800bp可行。

谢谢kaige88版主的及时回复！
1 我扩增的是一个酶原的基因，非常保守。扩增小片段是用的简并引物，扩增出来的长度预期的一样长（碱基一个不差）
2 这个酶原基因在其他不同种生物的氨基酸个数都在380左右
3 我刚又分析了一遍我拼接得到的全长3端没有加尾信号ATTAAA
4生工我现在都测怕了，以后还还是到英骏去测，浪费时间和老板的money啊！

呵呵，祝实验顺利！

请教下：你说没有加尾信号ATTAAA,ATTAAA是加尾信号吗？是不是应该是AAUAAA

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不好意思 我也不是很清楚