甲醇营养型巴斯德毕赤酵母研究进展

    近些年,甲醇营养型毕赤酵母（Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris）表达系统成为一优秀新型外源基因的真核表达系统。它已广泛应用于商业化生产。
    与常用的酿酒酵母表达系统相比，该系统具有以下优点：
    1.毕赤酵母醇氧化酶（Alcohol oxidase,AOX1）基因的强启动子特适合于外源基因的调控表达，但它受甘油或葡萄糖等碳源的阻遏，而受甲醇的诱导且诱导极其精确3；
    2.毕赤酵母基因操作技术和酿酒酵母（Sccharomyces cerevisiae）非常相似，后者是现代分子生物学中研究得透彻和应用很广的酵母表达系统；
    3.具有日螓成熟的高密度发酵工艺，廉价的原料配方；
    4.毕赤酵母对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长，亦有利于工业放大生产；
    5.外源蛋白分泌的高效率性；
    6.外源蛋白基因遗传稳定性高；
    7. 外源目的蛋白表达率高。
    8.作为真核生物，巴斯德毕赤酵母能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工。

1.1Pichia Pastoris表达宿主菌
    毕赤酵母表达宿主菌于80年代初开发获得，大多应用宿主菌是通过对野生型石油酵母Y11430进行突变改造而来。在组氨酸脱氢酶基因（HIS4）处有一突变，用于转化后筛选重组菌株。另外，其它的一些营养缺陷宿主菌或生物合成基因也可以作为筛选标记。
    目前主要有三种表达宿主菌6，它们间区别在于AOX一个或二个基因的缺失而造成对甲醇利用能力高低的变化。最常用的宿主菌为GS115（his4），它含AOX1和AOX2基因，在含有甲醇的培养基上以野生型速率生长。KM71（his4 arg4 aox1：：ARG4）宿主菌的AOX1已被S.cerevisiae的ARG4所取代，因此，此宿主菌只能依赖AOX2基因合成AOX，在甲醇中低速度生长。MC100-3（his4 arg4 aox1：：SARG4AOX2：：Phis4）宿主菌的两个AOX基因都被去除，不能在含有甲醇的培养基上生长。

1.2毕赤酵母表达载体
    毕赤酵母表达载体－AOX1）、多克隆位点（MCS）和一个从AOX1基因拷贝下来的终止序列（TT）；同时，大多数载体包含作为筛选标记的组氨醇脱氢酶基因HIS4和细菌中进行拷贝增值而存在的序列（如ColE1¢载体通常含有一个外源基因表达框、AOX1启动子（5 复制起始点和抗氨苄基因）；同时也含有AOX1 的非编码取序列，使外源基因能以替代或插入方式整合到染色体的AOX1部位。¢3

1.3外源蛋白在毕赤酵母中的表达
    载体整合方式通常有三种：一是双位点互换(Double AOX1、外源基因和转录终止区AOXt的表达单元置换染色体上有完整功能的AOX1基因，产生的表达菌的表型为His+Muts(或Mut-)。由于AOX1基因被置换，只能靠微弱转录的AOX2基因，因此甲醇利用率很低，但它表达外源基因的效率高。虽然Muts在甲醇培养基中生长缓慢，但有时在摇瓶培养条件下表达量更高7，不过由于其达到表达量高峰的时间过于漫长（150－200小时），所以不适合工业生产。二是AOX1单位点互换(Single¢AOX1及转录终止区。含5¢cross-over)，发生在染色体AOX1位点和表达载体的5 Cross-over)，发生在染色体AOX1位点和表达载体的AOX1区。外源基因的表达盒插在AOX1基因的上游或下游，这一过程可重复发生，即可获得更多拷贝的表达盒插入基因组内，AOX1基因仍然有活性，产生的表型是His+Mut+，这种His+Mut+转化子利用甲醇。三是HIS4单位点置换，发生在染色体HIS4位点和表达载体的HIS4位点，使得一个或多个表达盒插入在HIS4位点，产生的表型也是His+Mut+。HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入，整合后使组氨酸缺陷型宿主（his4）恢复野生型。HIS4区或AOX1区位点的整合都使转化子具有HIS4基因，因而可利用表型差异来进行筛选。当然也有His4双交换，结果为His-Mut+,不能被检出而已。
    分泌到发酵液中的外源蛋白由于复杂的环境很容易产生降解或灭活，其蛋白不稳定问题主要由毕赤酵母分泌的几种蛋白酶引起，在发酵罐中，降解尤为严重。。目前主要有三种方法10来解决蛋白的降解：第一，在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或胳蛋白水解物等，通过增加蛋白酶作用的底物来缓解蛋白酶的水解作用。第二，通过改变培养基的pH来加以改善，毕赤酵母可在3.0～8.0的范围内生长，但不同的pH对蛋白酶的影响不同，适当的pH可以有效抑制蛋白酶的活性。第三，产物的稳定性也可通过用蛋白酶缺失的菌株来提高。

1.5甲醇营养型毕赤酵母成功表达的外源蛋白
    自从1988年，一些医药和生物技术公司获得到了甲酵营养型毕赤酵母表达技术，其中大部分为医药制品，如白介素－2、人血清白蛋白、肿瘤坏死因子、乙型肝炎表面抗原、人巨细胞病毒（Cytomegalovirus）抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物（Hirudin variants）、血管紧张肽－I转换酶等等，其中乙型肝炎表面抗原、重组人血清白蛋白和胰岛素类生长因子用该技术进行了商业化生产，另外一些即将进入市场26，27。至今有四十多种蛋白用该菌进行了表达。

1.6毕赤酵母Pichia Pastoris工程水平上的研究进展
    基因工程毕赤酵母的高密度高表达的发酵过程优化是一个重要的研究内容，各研究者做了大量的实验研究工作，重点在碳源利用和甲醇诱导AOX合成和抑制上研究发酵过程控制策略，并结合氧的供应，pH调节和温度控制，针对Mut+,Muts等不同表型，形成了毕赤酵母发酵的不同工艺。菌体量可达到200克/升，外源蛋白表达量可达2-10克/升(如TNF、HSA等)。
    甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白时一般有二个阶段，一为酵母细胞营养生长阶段；二为外源蛋白表达阶段。酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，因而需要价低且能使酵母细胞生长迅速的碳源，通常为甘油和葡萄糖，而葡萄糖易产生葡萄糖效应，因而多用甘油作为唯一碳源，表达相时由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白。因此，表达时只有用甲醇来诱导。
    甲醇营养型毕赤酵母的氮源极其简单，通常为氨水。
    甲醇营养型毕赤酵母培养的温度通常为30℃，如果温度过高，细胞生长和表达外源蛋白将受到抑制，并且色素增加；如果温度过低，由于培养是散热的，因而培养开支要增大，且复杂的操作要增加；
    通常甲醇营养型毕赤酵母生长pH范围为2.0～7.5，最适生长pH为4.8-5.2，但外源蛋白表达最佳pH要视蛋白而定。因为pH对蛋白酶的稳定性有作用。甲醇营养型毕赤酵母表达重组外源蛋白时，许多人认为要补加一定量的氨基酸和甲醇营养型毕赤酵母生长及表达时所需的无机盐有Fe2+(Fe3+), Cu2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+, Ca2+等。

1.7总结与展望
    近几年，毕赤酵母表达体系有了更为广泛的应用范围，表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原和抗体、调节蛋白等各种类型。和其它体系比较，它在表达真核蛋白方面有更好的应用，国内虽然起步较晚，但用此体系成功表达出胰岛素、乙型表面抗原、降钙素等。我们实验室成功表达人血清白蛋白达6g/L，远远超过国内报道的表达量1.0g/L，超过国外报道的最高表达量3.39g/L。
    当然，毕赤酵母表达体系和其它体系一样，不是完美无缺的，低表达和表达失败的例子也在增多。如前面提到的蛋白水解问题，很多蛋白在毕赤酵母中只表达出蛋白片断或几条带共存，通过Western杂交表明是水解的结果；另外，对一些复合蛋白的分泌还不有效。
    对毕赤酵母发酵工艺也需要进一步优化，因为，调整发酵中的pH、温度可以有效抑制蛋白酶的活性，稳定目的蛋白，提高蛋白表达量。我们实验室利用生物参数检测（OUR、CER、RQ）与控制技术对发酵进行在线分析，运用参数相关性分析对过程进行调控，使白蛋白表达量达到上升。
    因此，毕赤酵母的更广泛应用还有待于此体系的进一步优化。在增强启动子、寄主菌的蛋白酶降解问题、发酵条件等方面得到突破后，毕赤酵母表达体系将有更好的应用前景。

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