外源基因在毕赤酵母中的表达及策略
外源基因在毕赤酵母中的表达及策略
外源基因在毕赤酵母 中表达一般首先应考虑选用什么载体，并且还应考虑目的片段大小，载体的容量，合适的酶切位点，以及有利于蛋白的下游加工等综合因素，选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点上。如果选用的是分泌型表达载体，则应考虑外源基因阅读框架和信号肽的阅读框架保持一致。
当重组载体构建好，只有通过内切酶线化后，其在酵母中的整合效率大大提高，根据不同载体特点，以及与酵母的整合方式不同，可以产生不同甲醇表型。这些可以通过MD或MM平板鉴定表型进行判别。转化甲醇酵母的方法有四种：原生质体法、电穿孔法、PEG法和 LICL法。原生质体法复杂但易产生高拷贝。电穿孔法简单方便，本实验室多采用此方法。PEG方法和LICL方法也尚可，但转化效率低，且不易形成多拷贝。
当转化子形成之后，可通过很多方式来达到筛选的目的，主要有组氨酸缺陷培养基上筛选，另外可通过PCR筛选，还有通过原位杂交进行。此方法虽然工作量大，但可大量筛选转化子和多拷贝。另一种方法就是通过抗生素筛选，如：G418、zeocin等不同的抗性浓度来达到筛选阳性转化子的目的。原则上抗生素的浓度越大，产生多拷贝的可能性越大。另外 pPICZa系列载体可通过人工构建多拷贝表达子。
外源目的基因在甲醇酵母的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达，先以甘油为碳源的培养基上增殖菌体，当达到013值为3—6时，离心弃上清后悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达，间隔24 h添加培养基总量的0.5％ -1％的甲醇，以弥补甲醇的消耗。在进行表达的过程中，各种条件有待优化，一旦最佳条件确定，即可按比例放大，进行高密度大规模 的发酵。
尽管甲醇酵母作为真核表达系统具有许多优点，含有强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，作为真核表达系统，可对表达后的蛋白进行加工和修饰，使外源蛋白具有生物活性。培养要求条件低、廉价、生长快、高密度发酵，表达量也高，如破伤风毒素片段c表达量达12g／L，可分泌到细胞外，背景蛋白含量低，易纯化。但还有许多因素影响外源基因在其中的表达，主要有以下因素：外源基因的拷贝数，mRNA 5’端和3’非翻译区(UTR)，外源基因的A+T含量及密码子的偏爱性，产物的稳定性和培养条件等。
外源基因的拷贝数
目的基因的拷贝数对表达量影响极大，不同的基因对拷贝数要求不一样：Cregg等认为在绝大多数酵母表达中，单拷贝基因与多拷贝对表达量无明显的影响，但是有些基因通过增加目的基因的拷贝可使表达量明显提高到几十倍。例如：植酸酶基因Phy，破伤风毒素c片段等；
Thiu等(1990)认为目的基因拷贝数对增加表达量没有负面影响。总之，基因拷贝数的多少在表达中的作用是难以预料的，具有实际意义的解决方法就是筛选一株高效表达的重组酵母。
mRNA 5’端非翻译区(UTR)
mRNA 5’端和3’端的UTR的长度及核苷酸序列对外源基因在酵母中表达影响很大。高效表达的AOX1基因的mRNA引导序列长度为114个核苷酸。该序列富含A端UTR与AOX1基因的接近或一致，才适合表达外源蛋白。Sreeckrisha通过修正人血清蛋白(HSA)基因的5’端UTR使表达量提高了50倍。目前商业化的酵母载体都具有此片段，另外大多数启始密码子AUG合适的“上下文”为 CCACCAUGG，处于这样序列的AUG容易形成完整的核糖体复体，启动蛋白质的合成。
外源基因 A+T的含量以及密码子的偏爱性
不同基因A+T含量差异很大，在毕赤酵母表达系统中，由于A+T含量过高会导致转录提前 终止；Clare等通过降低破伤风毒素c片段A十T的含量使其表达量提高；本文作者在表达口蹄疫病毒P2、P3区基因时，因其A+T的含量在30％ -50％之间，且都能实现正常表达。另外，不同的宿主菌对编码同一氨基酸的密码子使用频率不同，在 A+T含量没有明显差异的基因中，密码子的使用频率也不同，有些密码子使用频率高，有些使用低，这就是密码子的“偏爱性”。Shipingzhang(1991)等通过一系列试验比较发现了E.coli、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞的低利用率密码子，酵母的低利用率密码子。
姚斌等(1998)通过改造植酸酶基因ply，将3个编码Arg的密码子突变成高频率使用的AGA，其表达量提高了近37倍。本文作者在表达FMDVP1区基因时，也通过对低利用率密码子进行改造，以达到提高表达量的目的
产物的稳定性和培养条件
分泌蛋白能否稳定存在与培养基中的成分及条件有关系，一方面通过改变培养基的pH值可提高分泌蛋白的稳定性，一般推荐pH值范围在2.8—6.5之间，另一方面通过向培养基上加入考马酸、EDTA、YP来提高产物的稳定性。还有应用蛋白酶水解酶缺陷型菌株SMD1 168、SMD1 165、SMD1 163也可以提高表达产物的稳定性。总之，各种蛋白的表达条件须从各个方面着手，不断的摸索优化，才能达到最佳的表达量。搜索更多相关主题的帖子:
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