影响基因表达的因素
影响基因表达的因素
已有多种蛋白质基因在该系统得到不同程度的成功表达。表达的外源蛋白的产量除了受其本 身性质的影响外，其他一些影响基因表达和产物稳定性的因索也在很大程度上影响了产量的提高。
1 自主复制与表达盒的染色体整台
postoris中用得多的表达模式是利用一个整合型质粒进行染色体整合，这有几个好处：表达盒(序列组)稳定；产生多拷贝菌株；整合位点(HIS 4或AOXI位点)可以控制；产生不同的整合模式(AOX I基因编码序列存在或缺失)自主型载体质粒，如pHIL-AI，为低拷贝数，不稳定，固定地整合到一个或多个染色体位点(aOXI、HIS 4或ARSI)因此，利用自主复制型质粒，必须筛选分离稳定的整合子。在蛋白生产中，与线性化整合质粒相比，自主型质粒唯一的优势就是它们能以较高的转化率转化到pastoris原生质体中。
2 表达盒的整合位点
AOXI和HIS 4位点均巳得到成功应用．由于his4的染色体突变复制和表达盒中好的HIS 4基因问的保守性，HIS 4位点的lac Z基固表达盒有时会发生丢失因此，AOX 1位点相对
来说，更有利于应用。
3 宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts
末端与AOX1染色体位点的5或3区域同源的线形化DNA(如经BGl1酶切的Phil-D1，pHIL-D7或pP1C9；经Not I消化的pHIL-D2)转化P pastoris his 4缺陷型菌株，导致AOXI结构基固的位点特异替换.平均每20个His转化子中有1-5个发生AOXI基因的替换。AOXI基因缺失的克隆在最低量甲醇培养基中表现出生长缓慢的表型Muts)，而带有完整的AOX I基因的克隆则在最低量甲醇培养基中生长正常(Mut+)．对于胞内表达，最好利用细胞Muts，因为此时乙醇氧化酶的表达水平较低，表达产物易于纯化；而对于分泌表达，Mut+或 Muts均可。人们还发现，在两种表型的宿主细胞中，HAS(人血清白蛋白)基因的分泌表达没有什 么明显的差异。
4 基因剂量
有许多例子证明，单拷贝的表达盒也可得到最理想的表达产量。增加拷贝数对于提高产量没有明显的作用。然而在其它情况下，表达盒的多重拷贝(>10)对于高水平表达是必不可少的 拷贝数的增加对提高蛋白产量具有显著效果，如人的TNF、鼠的表皮生长因子和破伤风毒 素 片段C也有极少情况下，增加拷贝数反而降低了表达水平。
因此，基因拷贝数对表达的影响是无法预测的。解决这个问题的实际办法就是将基因剂量作为指标来检测产物的表达水平。P.pastoris转化的原生质体法，使转化子具有很宽范围的拷贝数，就象以前在s．cerevisiae中发现的一样。对 100个单克隆的分析是以挑选出一个产率最高的重组菌，如果运用其它的转化方法(LIC1法或电转法)不能产生较多多拷贝的话，可利用有救的鉴定方法，如利用 DNA探针进行菌落杂交(点杂交)，或增加抗生素浓度，利用高抗性(如G418)进行筛选。除此之外，人们还利用 DNA串联体转化酵母或利用特殊掏建的多拷贝载体(如 pAO856和pA0815)以获得表达盒的多拷贝基因。
5 mRNA 5’和 3’-UTR
核苷酸序列和5’--UTR(非翻译区)过长不利于蛋白质的最优化生产。高效表达AOXI的mRNA的前导肽长度为114 nt，且A+U含量丰富，为使异源蛋白的合成条件最理想，5’-UTR应尽可能靠近AOXI基因的mRNA，并保持一致。利用这种方法，HSA的表达水平提高了50倍。
6 翻译起始密码子AUG前后的序列
AUG应避免出现在5’-UTR，使mRNA从实际的翻译起始位点开始进行有效翻译。AUG周围mRNA的二级结构应进行调节，使AUG的二级结构象RNA折叠分析所预测的那样，具有相对的自由度，人们通过重新设计起始部分的编码序列达到这个目的。
7 A+T组成
A+T含量高的基因由于过早终止，因而不能有效转录。通常的策略是重新设计基因，以使AT含量保持在30％~55％间。利用这个方法，人们构建了各种重组苗，有效地生产了破伤风毒素片段C、Bcill~s ephaeria~灭蚊毒素、BSP I和 lISP IIn。在Pa pastoris中已证实，当 HIV-gpl20中阻止转录的序列5’-ATTATTTTATAAA 变成 5’-TTTCTTCTACAAG后，过早终止现象不再出现。设计合成基因时，可利用pastoris的偏爱密码子。
8 产物稳定性
分泌蛋白的水解稳定性可通过改变培养基的pH来提高，实验 pH范围是2.8~6.5．在培养基中加入Casamino acid或YP可大大提高产物的稳定性。例如，将培养基的pH从5.2增加到6.0，HSA的分泌水平可明显提高；若在培养基中加人YP，则产量可进一步增加。加5 mnoL／L EDTA到培养基也能提高产物的稳定性。利用S cerevisiae的PEP 4基因在P pastoris中的同源区缺失菌，如SMDI168(his4，pep 4)、SMDl165(his4，prb 1)和 SMDl163(his 4，pep 4，prb 1)来提高产物的稳定性，如发酵罐中IGF-I的产量增加了约50％。而且，pep4突变菌株和野生型菌株生产的IGF-I纯化后发现，pep 4突变株培养基中的IGF-I更稳定，这就说明减步蛋白降解致使产量明显提高。
9 发酵新策略
通过利用甲醇以提高生物量的连续发酵方式不适合Mut菌株。Craze JA和Prevatt WD在寻找促进生长、且不阻遏AOX I基因启动子的甲醇诱导功能的碳源时发现，山梨醇和丙氨酸是两种最好的底物。最近利用山梨醇+甲醇混合培养基进行的分批发酵在Biostat-B(Braun)台式微量发酵罐中完成MMP-2生产的几个循环，4 wk内生产出25 L含MMP-2的培养基。该方法对Mut+细胞同样有效，因为它减少了甲醇的总消耗量，大多数的生长靠山梨醇来支持，甲醇可在任何需要的时间点添加到山梨醇中诱导表达川．搜索更多相关主题的帖子:
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