影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达的因素
影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达的因素及优化策略
虽然毕赤酵母表达系统已经引起广大研究者的关注，但在实际应用和生产中，实现在毕赤酵母表达系统中高效生产外源蛋白还受多方面因素的影响。
1 宿主茵的影响
有些宿主菌的转化子是Muts表型，如KM71转化子；有些是Mut+表型，如GS115转化子。哪一种表型对外源蛋白的表达量更高，对每一种蛋白而言是不确定的，因此在Mut+表型的菌株中表达水平较低时，可以尝试用Muts表型的菌株来表达。另外，选择具有强启动子，带有抗性标记、多拷贝筛选标记、蛋白水解酶缺失的宿主菌，既利于操作又利于高效生产外源蛋白。
2 表达载体的影响
应用毕赤酵母表达外源蛋白时既可选择胞内表达载体，又可选择分泌型表达载体。一般而言，对于非分泌蛋白采用胞内表达载体，而对于正常分泌蛋白则选择分泌型载体，这样更有利于表达产物的分离纯化。毕赤酵母载体中最常用的启动子为甲醇诱导性很强的AOX1启动子，由它控制的外源基因通常能得到高效表达。
3 外源基因自身的影响
外源基因的特性是决定表达成败的首要因素。外源基因序列中mRNA 5端非编码区(5r-UTR)的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。适当长度的5’非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译，5-UTR太长或太短都会造成核糖体40 S亚单位识别的障碍。AOX1基因5r-UTR长为1l4nt，并富含A+U，其编码的乙醇氧化酶表达量极高，故维持外源基因mRNA 5r-UTR尽可能和AoX1 mRNA 5-UTR相似是必需的，最好是保持两者一致。A+T含量高的基因在甲醇酵母中表达时，有时会造成转录提前终止，共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号。另外在A+T丰富区还存在一些没有确定的转录提前终止信号。因而对A+T含量丰富的基因，最好是重新设计序列，使其(A+T)含量在30％~55％范围内。这种方法使人血清白蛋白(HAS)的表达量提高50倍左右。用这种方法可使破伤风毒素C片段得到高效表达。某些稀有密码子，尤其是稀有密码子密集区往往也成为制约翻译速率的因素，所以应该使稀有密码子突变为酵母所偏爱的密码子来提高表达效率，对这些偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正比。因此，要得到高效表达，最好对外源基因进行改造，选用甲醇酵母偏好的密码子，尽量使mRNA5’非翻译区的核苷酸序列和长度与醇氧化酶的相似。
酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近 的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。
外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。
外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。
4 培养条件的影响
培养条件主要包括培养基、通气量、pH值、甲醇含量、培养时间、培养温度等。培养基主要对生物量和诱导表达有影响。在培养基中添加特殊的营养物质(如添加限制氨基酸；在表达含有金属的酶时，在培养基中添加金属元素)，能提高一些特殊蛋白的表达水平。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要，应该保持高通气量。实验室里在三角瓶中培养时可以加人适当的缓冲液调整pH值，以保持最高程度的通气量来满足诱导表达的需要。甲醇诱导的方式、用量、诱导时间都会影响外源蛋白的表达水平。在诱导期间每天应往培养基中补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发；但由于培养条件和转化子表型不同，添加甲醇的量也有所不同，一般添加量为培养基体积的0.5％～1％。诱导时间过短则表达量很低，过长则外源蛋白的降解增加，应根据菌株的需要选择合适的诱导时间，一般诱导时间在150 h左右。另外，甲醇诱导表达时，培养温度不宜超过30℃。
5 转化方法及阳性转化子的筛选鉴定
因为表达单位的不同整合方式、拷贝数、阳性转化子、表达量的特异、快捷鉴定方法对获得高表达株具有重要意义，所以应采用既操作简便又可提高转化率和表达单位拷贝数的方法来转化，具体选择哪种方法应根据实验条件具体选择常用的4种转化方法中的一种。
小量摇瓶试验是筛选转化子简便而有效的方法。但是摇瓶培养中表达外源蛋白的水平往往不能准确反映发酵罐中的情况，为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件实验，现在可用SCM摇瓶技术来筛选阳性转化子。
6 信号肽的影响
分泌表达既可以减轻宿主细胞代谢负荷，又可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白的降解，是一种理想的蛋白质生产方式。分泌表达既可利用外源蛋白自身信号肽又可利用酵母菌a-因子 信号肽来表达外源蛋白，如果自身的信号肽序列效果不佳则可尝试用甲醇酵母的信号肽。如 果外源基因产物不能分泌到体外，则可将产物连上一个定向肽，使其定向运输到过氧化物酶体中，以免产物积累对宿主细胞造成毒害，同时产物自身的稳定性也会大大增强。另外，还有一个问题是信号肽加工不完全，其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸残基，这可能是酵母自身调节机制对外源基因高表达的应答反应，此问题可以通过定向缺失诱变来 解决。
巴斯德毕赤酵母表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的翻译后蛋白加工，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。随着对巴斯德毕赤酵母表达系统的研究的广泛深人，该表达系统也将更完善。相信在将来的理论和实践中，如在分子生物学基础研究、基因工程产品开发、生物催化剂、生物制药等诸多应用领域中也必将发挥巨大作用。搜索更多相关主题的帖子:
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