甲醇酵母表达外源蛋白的一般步骤
甲醇酵母表达外源蛋白的一般步骤
在甲醇酵母中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。
1．克隆
选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分泌型表达载体，则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。
2．重组栽体线性化
重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。如对载体pPC19选用BgiⅡ线性化，转化后可得到Muts表型转化子；选用SaI或StuI线性化，转化后可得到Mut+表型转化子。
3．转化
选用上述四种方法中的一种转化。一般选用原生质球或电击法。
酵母的高效转化
1．接种5ml液体YPAD或10ml SC，30℃下振荡培养过夜。
2．计数过夜培养物细胞密度，以最终5×106个/ml的细胞密度接种50ml YPAD培养液。
3．置30℃，200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml，通常需要3～5小时，该培养物的细胞足够供十次转化用。
4．用50ml无菌离心管以3000g（2500r/min）离心5分钟，收获细胞。
5．弃培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，再同上离心。
6．弃水，把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。
7．高速离心5秒钟沉淀细胞，用微量移液器吸出醋酸锂。
8．悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂。
9．将1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却。
10．振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂。
11．基本“转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序如下：
240μl PEG（50% w/v）
36μl 1.0mol/L 醋酸锂
25μl 单链载体DNA（2.0mg/ml）
50μl 水和质粒DNA（0.1～10μg）
12．剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀，通常需要1分钟左右。
13．置30℃保温30分钟。
14．置42℃水浴中热激20～25分钟。
15．以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液。
16．吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。
17．用等份的200μl转化混合液涂选择平板。
4．筛选
转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA，用外 源基因两侧特异引物扩增筛选。然而，这只限于少量转化子转化子。太多则工作量太大。对于大量转化子的筛选，可用原位点杂交进行。即把相同量的不同转化子点在NC膜上，在原位对酵母细胞壁进行裂解，使之释放DNA。DNA经变性、中和后，可和由外源基因制备的探针杂交。用这种方法，在一张Nc膜上，可完成对几百个转化子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子，而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时，转化子中外源基因拷贝数越多，则杂交后信号越强。
5．鉴定表型
筛选出的转化子需鉴定表型，即确定是Mut+还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的转化子为Mut+；相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Mutd。
6．诱导表达
外源蛋白在甲醇酵母中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心弃上清，菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达。每隔24小时加一次甲醇，以弥补甲醇的损失。表达的条件有待优化，如通气状况，pH值，培养基的组成等等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大。从摇瓶培养转至大规模发酵。搜索更多相关主题的帖子:
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