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小 发表于 08-2-19 15:08 只看该作者
酵母的高效转化
酵母的高效转化
1．接种5ml液体YPAD或10mlSC，30℃下振荡培养过夜。
2．计数过夜培养物细胞密度，以最终5×106个/ml的细胞密度接种50mlYPAD培养液。
3．置30℃，200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml，通常需要3～5小时，该培养物的细胞足够供十次转化用。
4．用50ml无菌离心管以3000g（2500r/min）离心5分钟，收获细胞。
5．弃培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，再同上离心。
6．弃水，把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。
7．高速离心5秒钟沉淀细胞，用微量移液器吸出醋酸锂。
8．悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂。
9．将1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却。
10．振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂。
11．基本“转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序如下：
240μlPEG（50%w/v）
36μl1.0mol/L醋酸锂
25μl单链载体DNA（2.0mg/ml）
50μl水和质粒DNA（0.1～10μg）
12．剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀，通常需要1分钟左右。
13．置30℃保温30分钟。
14．置42℃水浴中热激20～25分钟。
15．以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液。
16．吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。
17．用等份的200μl转化混合液涂选择平板。
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实迷途其未远，觉今是而昨非
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