流式细胞仪标本的制备
流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的
结果。
　　(一)　原理
　　活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
　　(二)　操作步骤
　　　　　制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为
　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)
　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS
　　　　　　　　稀释)灭活正常兔血清
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min
　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右
　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠
　　　　　　　　　(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃ 30min
　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右
　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入
　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液)
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
　　　　　　　　　　(标本在试管中可保存5～7天)
(三)　试剂和器材
　　1.　各种特异性单克隆抗体。
　　2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
　　3.　10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
　　4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
　　(四)　注意事项
　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
　　附:
　　1. DPBS (×10, 贮存液)
　　　　NaCl 80g
　　　　KCl 2g 　　　　　蒸馏水加至1000ml
　　　　Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
　　　　KH２PO４ 2g
　　2.　洗涤液
　　　　DPBS　　　　　　900ml
　　　　FCS 50ml (终浓度　5％)
　　　　4％NaN３50ml (终浓度0.2％)
　　3.　固定液
　　　　DPBS　　　　1000ml
　　　　葡萄糖　　　　20g (终浓度2％)
　　　　甲　醛　　　　10ml
　　　　NaN３　　　0.2g (终浓度0.02％)

ELISA
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

　　(一)　原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

　　(二)　操作步骤
　　方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。
　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。
　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
　　方法二　用于检测未知抗体的间接法：
　　　　　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，
　　　　　　每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔
　　　　　　中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)
　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，
　　　　　　37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
　　　　　　　　　　　　　　↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

　　(三)　试剂器材
　　1.　试剂
　　(1)　包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):
　　　　　　NaHCO３   1.59克
　　　　　　NaHCO３　 2.93克
　　　　　　加蒸馏水至1000ml
　　(2)　洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M
　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克
　　　　　　Na2HPO４•12H2O　　2.9克
　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克
　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克
　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml
　　　　　　加蒸馏水至1000ml
　　(3)　稀释液：
　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克
　　　　　　　加洗涤缓冲液至100ml
　　　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。
　　(4)　终止液(2M　H２SO４）：
　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
　　(5)　底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):
　　　　0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml
　　　　0.1M 柠檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml
　　　　加蒸馏水50ml。
　　(6)　TMB(四甲基联苯胺)使用液:
　　　　TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml
　　　　底物缓冲液(PH5.5)　　　 10ml
　　　　0.75％H２O２　　 　32μl
　　(7)　ABTS使用液:
　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg
　　　　底物缓冲液(PH5.5)　 1ml
　　　　3％H２O２　 　2μl
　　(8)　抗原、抗体和酶标记抗体。
　　(9)　正常人血清和阳性对照血清。
　　2.　器材:
　　(1)　聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
　　(2)　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。

　　(四)　注意事项
　　1.　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
　　2.　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
　　(1)　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
　　（2） 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
　　(3)　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
　　(4)　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

免疫胶体金的制备及其应用

胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。
　 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链ＤＮＡ抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。

免疫胶体金技术的基本原理
　　氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
　　免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
　　
胶体金的制备方法
　　胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。
　　１、玻璃容器的清洁：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。
　　２、试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其１％水溶液在４℃可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。
　　金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变，应选用缓冲容量足够大的缓冲系统，一般采用柠檬酸磷酸盐(pH3～5.8)、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.5～10.3)等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。
　　３、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶：
　　取0.01％氯金酸水溶液100ml 加热至沸，搅动下准确加入１％柠檬酸三钠水溶液 0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在２分钟内变为紫红色，继续煮沸１５分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm，Ａ1cm/535=1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。
　　金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见附表。
附表 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响
１％柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00
金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙
吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518
径粒(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15
　　４、柠檬酸三钠－鞣酸混合还原剂：用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶，操作方法如下：取 4ml１％柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml 25mmo/L K2CO2（体积与鞣酸加入量相等），以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml，加热至60℃取1ml１％的 HAuCl4，加于79ml双蒸馏水中，水浴加热至60℃，然后迅速将上述柠檬酸－鞣酸溶液加入，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色(约需0.5～1小时)后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾５分钟即可。改变鞣酸的加入量，制得的胶体颗粒大小不同。
　　５、白磷还原法：在120ml双蒸馏水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置15分钟，在回流下煮沸 直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约 6nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。
　　要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数（ＣＶ）可小于１５％。
免疫胶体金制备
　　１、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
　　一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
　　２、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，５分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置２小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。
　　３、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
　　下述标记步骤最为常见：
　　①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记ＳＰＡ时调到pH6.0)。
　　②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为２～３ml），搅拌２～３分钟。
　　③加入5ml１％PEG20000溶液。
　　④于10000～100000g离心30～60分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。
　　⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 Ａ1cm/540nm=1.5左右为宜，以 0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。
　　⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1％ＢＳＡ的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以Ａ蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
　　以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
　　
胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存
　　胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。
　　金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。
　　当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液pH而变化，而这种变化又取决于吸附蛋白质的等电点，如ConA，过氧化物酶等，当pH较低时保持稳定，提高pH则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在4～10℃贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。
免疫胶体金的应用
　　１、胶体金在电镜水平的应用
　　胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为3～15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。3～15nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。
　　胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织抗原的检测。
　　金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。
　　实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。
　　２、胶体金在光镜水平的应用
　　胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：①用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。②检测培养的单层细胞胞内抗原，③组织中或亚薄切片中抗原的检测。
　　胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。
　　３、胶体金在流式细胞仪中的应用：
　　应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。
　　４、凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。
　　５、免疫印迹技术(immunoblotting)：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫荧光、ＲＩＡ）进行定量。
　　免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌Ａ蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。
　　利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。
　　由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。
　　６、胶体金在肉眼水平的应用
　　胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：①试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2ul；②不需γ－计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用； ③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；④实验结果可以长期保存；⑤时间大大缩短，提高了检测速度。金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。
　　　
胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应用
　　　　免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝 酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。
　　早孕诊断用的免疫层析试纸条（通常又叫尿妊纸条）的装配结构见图一。
　　装配方法：在塑料底板上分别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标记抗α－HCG玻璃纤维、已固定有抗β－HCG抗体的NC膜及硬质吸水滤纸按图装配，配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽 度为4mm的条状，即为尿妊用纸条。
　　本法检测速度快，一般一两分钟可出结果；灵敏度高，可达50IU/L；好的试纸条结果也是准确可靠的，这是其所以能在尿妊诊断中得到广泛应用的主要原因。尿妊试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性，但与原材料选择特别是NC膜的孔径大小密切相关，准确性取决于抗β－HCG的特异性。
　　金标尿妊纸条虽然好用，但在使用中也必须注意以下几个方面：一是温度，试纸条虽然可在室温保存，但大批暂时不用的试纸条还是应该放在４℃保存，以免抗体失效，从冰 箱刚取出的试纸条则应待其恢复至室温，然后才打开密封，可避免反应线模糊不清。二是正确操作，一般的操作方法是在试纸条的吸尿玻璃端滴入２滴（约１００微升）尿液，或将吸尿端直接插入标本中，深度约１０～１５毫米２０秒，取出后平放，这种方法比较麻烦且容易造成污染。我们的方法是取尿标本约0.5ml 加入小试管中，然后插入试纸条，待１～２分钟反应带清晰后观察结果。

胶体金在快速斑点渗滤技术中的应用
　　ＥＬＩＳＡ法在临床实验室已得到普遍的应用，特别是用于各型肝炎标志物的检测。但ＥＬＩＳＡ法由于操作程序复杂，时间较长，给实验室带来不便。因此出现一步法快速检测试剂盒，虽可提高检测速度，但有出现假阴性结果的弊端。ＥＬＩＳＡ法需时较长的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗体）需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应不适当地缩短反应时间，将使灵敏度降至临床要求以下。为满足临床快速检测的需要，近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法，快速斑点渗滤法即为其中一种，其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法Dot-immunogold filtration assay)，又称滴金免疫法。
　　快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。间接法测抗体：固定于膜上的特异性抗原＋标本中的相应抗体＋金标记的抗抗体或ＳＰＡ显色。夹心法测抗原：固定于膜上的多克隆抗体＋标本中待测抗原＋金标记的特异性单克隆抗体显色。
结果判断：快速斑点免疫金渗滤法在操作完成后即可直接观察结果。根据测定模式的不同可有以下不同的判定结果。
快速斑点免疫金渗滤法检测速度快，结果观察一目了然，已应用于多种临床检测项目。
　　以上分析可以看出，胶体金标记技术是继三大标记技术之后，又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫标记技术。

与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。
进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。
1）用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。
2）将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)－纤维素最大量为10mg总RNA，如果总RNA的量较少，则应减少oligo(dT)－纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。
3）用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液
20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
0.5mol/L NaCl
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.1％SDS
可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液；将适量无RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液（参见344页）混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌，待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10 ％SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl 然后用DEPC处理柠檬钠－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。
4）用灭菌水溶解RNA，于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温，加等体积的2x层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的RNA溶液均进入柱床后，加1倍体积的1x层析柱加样 ，继续收集洗出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。
5）当全部溶液流出后，将收集液置于65℃温育5分钟，重新上样，并收集流出液。
6）用5-10倍柱床体积的1x层析柱加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液，测定每一收集管的OD260。最补由于不带poly)A)的RNA洗过柱床， OD260会很高，后来OD260值则很小或为零。在某些方案中，上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的1x 层析柱加样缓冲液洗柱床，然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有， 因此这一步骤可以省略。
7）用2－3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA，以1/3－1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液
10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.05％SDS
用于配制洗脱缓冲液的Tris. Cl 和EDTA贮存液应为新近高压的溶液 可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理，因高压会使溶产生大量气泡。
8）收集液置于透明的小溶器内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮oligo(dT)－纤维素亲和量层析后得到的RNA中，带与不带poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA，可将洗脱液于65 ℃温育3分钟，迅速冷却至室温，加入NaCl至终浓度为0.5mol/L，用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。
9）收集oligo(dT)－纤维素柱层析的洗脱液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇，混匀，冰浴至少30分钟。
10）于4℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA，小心弃去上清液，用70 ％乙醇洗涤沉淀（通常看不见沉淀），离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。
11）用少量水重溶RNA，置于比色杯内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗
12）将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内，加3倍体积乙醇， 混匀，于－70℃保存备用。回收RNA时，只需取出一小份贮存液，加3mol/K乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L， 混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。
i.OD260＝1的溶液其RNA含量约为40μg/ml.
ii.从107个哺乳动物培养细胞中可获得1－5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1－2％。

蛋白质组学研究

人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要10年时间进行识别。
　　为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomic solution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成：
　　一、2-D电泳系统（Investigator? 2-D Electophoresis System）
　　该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser?（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。
　　产品特征：
　　 * 提供2D PAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间
　　 * 高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离
　　 * 大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶
　　 * 灵活性：该系统用于管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用
　　 * 恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化< 0.5℃
　　 * 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统
　　 * 提供超纯的相关化学试剂和药品
　　二、蛋白凝胶成像系统（Investigator? ProImage）
　　ProImage专业的蛋白凝胶成像系统提供高灵敏度、高分辨率的大面积蛋白凝胶成像和分析。
　　产品特征：
　　* 高灵敏度，高分辨率数字成像系统
　　* 12 bit冷CCD数码相机系统，大大提高图像信噪比
　　* 提供白光和紫外光源,可对银染、荧光、胶片、考马斯亮蓝、EB染色图像进行数字化
　　* 可以配合HT PC Analyzer蛋白质组学分析软件进行各种图像分析
　　* 多用途暗箱，保证无任何光线泄漏，免除实验室的暗房设备
　　* 对高灵敏蛋白荧光染色剂SYPRO? Ruby染色图像进行最优化
　　* 光照均匀，最大成像面积达25 x 28 cm
　　三、蛋白质点自动切取机器人平台（Investigator? ProPic Workstation）
　　Investigator? ProPic工作站主要用于2-D蛋白凝胶上蛋白质点的自动切取，可对考马斯亮蓝、银染、荧光染色的蛋白凝胶进行操作，广泛应用于制药公司、大学和重点研究所等进行高通量蛋白质组学研究的单位。Investigator ProPic是第一个将2-D凝胶成像分析和蛋白质点自动切取两个功能整合在一起的机器人工作站，主要为蛋白质组学研究的后续分析采集和提供样品，该产品市场占有率在同类产品中最高。
　　产品组成：
　　* 硬件部分：密闭暗箱及带有XYZ机器人手臂，具有100mm的切割精度，内置可换光源（白光和紫外光源），能容纳8块96微孔样品板的样品盘，并装配Gilson泵系统和12位高分辨率冷CCD数码相机的成像系统。凝胶成像和蛋白质点切取功能的整合，使得成像后凝胶不必移动而原位切取，避免移动过程中产生的位移和污染；切取结束后，可再次原位成像，检查切取结果准确性；可对操作过程实时监控。切取速度达120个/小时；全封闭的操作环境，有效防止角蛋白污染；超声水浴清洗和泵冲洗两种方式清洗枪头，有效防止样品交叉污染；污染最小化。内置水合装置，有效避免操作过程中因凝胶变干而影响切取准确性和样品回收率。
　　* 软件： HT Investigator PC Analyzer and Database,能进行高通量的蛋白凝胶图像分析，功能强大,处理量大；专业软件ProPic能自动控制数码相机曝光和切割机器人的采样操作；可由软件分析自动生成蛋白质点切取列表，亦可通过手动的point-click模式生成切取列表，在8小时的操作周期内无需专人管理，完全自动化，结果可靠。操作系统：Microsoft Windows 98/NT。
　　四、蛋白凝胶图像分析专业软件（Investigator? HT PC Analyzer）
　　该软件适用于大规模、高通量蛋白质组学研究实验室，能快速处理大量2-D蛋白电泳凝胶图像，能够对蛋白质点进行自动识别、定量和比较；软件功能强大、界面友好，容易使用。
　　产品特征：
　　* 能自动识别、定量和比较2-D蛋白凝胶图像;
　　* 自动计算2-D凝胶上蛋白质点的分子量和pI值；
　　* 能自动生成蛋白表达量变化曲线或柱形图
　　* 自动化、批处理和强大的编辑功能大大加快研究进程
　　* 通过创建True Average Gels克服样品和试验误差
　　* 能进行半自动或全自动蛋白质点匹配，不需用户提供标记
　　* 可对多块相应凝胶上的蛋白质点数据进行T-检验或其它统计分析;
　　* 数据可以传送给Investigator ProPic?自动工作站进行蛋白质点自动切割;
　　* 带有HT PC 数据库系统，可以方便进行蛋白研究的数据查询和数据管理;
　　五、自动化蛋白酶解工作站（Investigator? ProGest）
　　Investigator ProGest自动化蛋白酶解工作站是进行全自动蛋白酶解的最佳选择，适合于从2D或SDS-PAGE胶上切取胶块的自动化酶解。通过触摸式显示屏界面方便地进行反应程序的设定，从而实现酶解过程中的自动清洗，加酶和恒温孵育步骤循环。
　　产品特征：
　　* 进行自动化、高通量的蛋白斑点酶解
　　* 自动化操作和温控反应系统节约反应时间，提高反应效率，微处理器精确控制酶解反应条件
　　* 内置加热平台
　　* 专利的Flow-through技术，提高反应效率
　　* 能够同时进行96个样品反应,每轮反应时间为6.5小时
　　* 自动控制酶解反应循环时间，每天可进行两轮反应
　　* 氮气正压，超净环境
　　六、自动化MALDI点样工作站（Investigator? ProMS MALDI Spotting Workstation）
　　Investigator? ProMS 系统用于蛋白质质谱分析前的样品浓缩、脱盐和MALDI点样,点样的多肽可以进行后续的质谱分析，ProMS适用于大多数商业化的MALDI target。
　　产品特征：
　　* 软件操作方便，可根据用户需要进行定制，应用灵活，可远程控制，高通量。
　　* 溶液反应体系可对反应精确控制，多肽的反向洗脱增加检测灵敏度。
　　* 提供正压的干净空气
　　* 可以使用ZipTips?或类似产品
　　* 96孔规格
　　* 单泵分装
　　* 低流速（20 μl/min）增加纯化效率
　　七、自动化蛋白质酶解点样工作站（Investigator? ProPrep Workstation）
　　Investigator? ProPrep Workstation将能够自动完成凝胶蛋白质点酶解及酶解后样品的浓缩，脱盐和MALDI点样等一系列过程，通过4个样品针头同时操作使得实验结果高效和自动化。该仪器简化了蛋白质组学研究的繁琐步骤，大大加快了研究的实验进程。酶解后的样品适用于多种后续分析，包括LC（液相色谱）和CE（毛细管电泳），尤其适用于质谱分析，如MALDI TOF和MS/MS。该系统的酶解和MALDI点样两个操作过程可以分开单独进行，也可以整合成一个完整的过程进行自动化操作。
　　产品特征：
　　* 多功能：同时具有自动化蛋白质酶解和MALDI点样功能
　　* 高通量：酶解样品处理能力达1536个/天或更多；MALDI点样速度因方法和介质不同而不同
　　* 无污染：独特的反应槽设计有效地防止样品交叉污染，HEPA滤过的干净操作环境，有效防止角蛋白污染；自动化操作减少了手动接触污染
　　* 灵活性：提供4*96和8*96的样品盘满足不同通量的需求
　　* 操作方便：Window 2000系统和15寸平面液晶显示屏使得操作更舒适方便；软件?操作简单，PC内置软驱和CD-ROM及10/100M网卡,使数据交换和共享更容易。
　　* 灵敏度达125 fmol
　　八、RADARS/MS?快速数据管理和检索系统（Rapid Data Archival and Retrieval System ）
作为Genomic Solutions Inc.公司旗舰产品的RADARS/MS?快速数据管理和检索软件系统，是一个完整的蛋白质组学研究智能平台。它整合了客户机/服务器，数据库和外联网（extranet）应用软件，可以方便地进行蛋白质的分析鉴定和传输。它提供目前最快、最可信和最完整的蛋白鉴定解决方案。通过RADARS/MS系统可以方便分析大量的蛋白质组学研究数据，快速发现和确认药靶及疾病标志物，尤其适合于蛋白质组学研究中心、重点实验室和制药公司。
　　特点：
　　* 能自动化分析大量质谱数据
　　* 蛋白序列和质谱数据自动对应
　　* 快速分析蛋白翻译后修饰位点
　　* 蛋白组研究的实验数据和分析结果能进行快速数据库储存
　　* 对MS和MS/MS结果数据能进行快速自动化的数据库查询和蛋白鉴定
　　* 提供清晰、有效的结果可视化和注释工具
　　Genomic Solution Inc.系列仪器及软件为蛋白质组学研究提供了完整的解决方案，大大加快了研究进程，提高了实验效率。该系统非常灵活，用户可以根据自己现有的设备情况，有选择性地配备Genomic Solution Inc.系列仪器及软件，形成适合自己的一整套完整蛋白组学研究系统。

很好！

很好很有用！谢谢！