真核生物表达系统研究进展
真核生物表达系统研究进展
郑光宇
(北京师范大学 生命科学学院，北京100875)
基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表达，使许多难以制备的蛋白得以表达．大肠杆菌 E．coli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达。但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；真 核蛋白在E.coli的表达会有更多的问题，由于真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列。另外，真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。因此发展了各种表达系统，主要有传统的酿酒酵母表达系统，正在发展的毕赤酵母表达系统和丝状真菌表达系统。
1 毕赤酵母表达系统
毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统为20世纪80～90年代发展起来的优良的酵母表达系统。
由于该系统较原核生物及其它真核生物表达系统有众多优点，已被广泛地用于外源蛋白的表达。其优点为：(1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alocho Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；(2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；(3)营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产；(4)具有强烈的好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g／L以上；(5)外源基因单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定，表达量高，许多蛋白可达到g／1以上水 平；(6)在P.pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；(7)糖基化程度低，其糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，而且表达产物不含有毒物质和致热原。
毕赤酵母表达宿主菌
毕赤酵母的一个重要特性是能利用甲醇作为惟一的碳源和能量来源。毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。乙醇氧化酶(AOX)的合成是靠转录水 平调控的，其基因启动子为诱导型。所以甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如AOX，DHAS和过氧化氢酶(Catalase)，在强启动子的控制下这些酶的表达量甚至可达到总细胞蛋白的 60～80％。而以葡萄糖、甘油、或乙醇为碳源时，AOX几乎不表达。
毕赤酵母表达宿主菌于 80年代初开发获得。常用宿主菌大多是通过野生型石油酵母Y1143进行突变改造而来。在组氨酸脱氢酶基因(HIS4）处有一突变，用于转化后筛选重组菌株。其他的一些营养缺陷宿主菌或生物合成基因也可作为筛选标记。目前主要有3种表达宿主菌，它们之间的别在于AOX一个或二个基因的缺失而造成对醇利用能力高低的变化。最常用的宿主GS11(his4)，它含AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培养基上以野生型速率生 长．KM71(his4 arg4 aox：：ARG4)宿主菌的AOX1已被S.cerevisiae的ARG4所代替，因此，此宿主菌只有依赖 AOX2基因合AOX，在甲醇中低速度生长。第3种宿主菌MCIO0—3(his4 arg4 aoxl：：SARG4AOX2：：Phis4的两个AOX基因都被去除，不能在含甲醇的培养基上生长。上述宿主菌的进一步改造，还可得到其它衍生的宿主菌，目前已有十几种不同基因型SMD1163(his4pep4prb1)，SMD1165(his4prb1)和SMD1168(his4pep4)是最近开发的一类蛋白酶缺失的宿主菌，可减少表达外源蛋白的降解，有广泛的应用价值。
1．2 毕赤酵母表达载体
毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载体，但以整合型载体为主。常见的整合型载体又分为表达胞内蛋白和分泌表达两类，表达胞内蛋白的载体有：pPIC3、pPIC3K、pHIL—D2pPICZA (B，C)等；分泌表达的载体有：pPIC9 pPIC9K、pHIL—S1、pACO815、pPICZaA(B，C)等通用的整合载体多含有AOX1启动子，具有多种共同特性。一般都有一个外源基因表达框和AOX启 动子、多克隆位点(MCS)和一个从AOX1基因上拷贝下来的终 止序列(TT)同时，作为筛选标记的HIS4基因和在细菌中进行复制起始点和选择标记(如 ColEI复制起始点和抗氨苄基因)；同时也含有AOX1 3的非编码区序列，使外源基因能以同源重组的方式整合到染色体的AOxl位。
1．3 外源蛋白在毕赤酵母中的表达
迄今已有200多种外源蛋白在毕赤酵母中获得表达。为了获得高而稳定的外源蛋白表达菌株，通常是将巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。外源蛋白在毕赤酵母中的表达分胞内表达和分泌到胞外两种方式。胞内表达如破伤风毒素蛋白的产量达12 g／1。胞外蛋白的表达如人血清白蛋白，利用诱导型高效启动子 AOX1，分泌的外源蛋白占所有分泌蛋白的80% 以上，分泌表达量为10 g／1。由于毕赤酵母只分泌很低水平的内源蛋白，分泌表达的外源蛋白纯化非常方便，故分泌表达为优先选择的方式。但基于蛋白稳定性和折叠的需要，分泌表达方式通常限于天然宿主的分泌蛋白，而天然非分泌蛋白往往难于分泌表达．
1．4 毕赤酵母表达系统的优化
尽管毕赤酵母表达系统已成为分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一，但也有许多蛋白表达不理想，甚至不表达．要实现目的蛋白在毕赤酵母中的成功表达并兼顾其实用性和安全性。必须充分考虑影响表达和应用的各种因素并采取有效的优化策略．
1．4．1目的基因特性的改造
目的基因的特性是决定表达成败的首要因素。许多基因特定的A+T富含区可作为多聚腺苷酸或转录终止信号，导致仅产生低水平或截短的mRNA。某些稀有密码子，尤其是稀有密码子富集区往往也是制约翻译速率的因素。在某些情况下可通过定点突变去除成熟前终止结构域和替换稀有密码子。在基因中存在大量A+T富含区和稀有密码子密集区时，往往需要进行全基因合成，使编码序列符合毕赤酵母偏爱性密码子用法和具有更高的G+C含量。
1．4．2 启动子的选择
乙醇氧化酶1启动子PA0x是应用最广泛的甲醇诱导型强启动子。但在某些情况下PAOx1的使用受到限制，例如：甲醇有毒不适用于食品工业生产，也是一种火灾隐患。故其它非甲醇诱导的启动子也很引人注目。PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是一种组成型强启动子，是用该启动子在发酵时不需甲醇诱导，也不必更换碳源，工艺简单。但PGAP不宜于表达对 毕赤 酵母有毒的蛋白，Prm (依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶启动子)在以甲醇为单一碳源或甲胺为单一氮源时，被强烈诱导，这不仅为启动子的选择提供了灵活性，也扩大了毕赤酵母的应用范围。
围．
1．4．3 糖基化的消除
毕赤酵母可对分泌蛋白进行O-和N-连接糖基化修饰，虽然糖基化程度不高，但毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差异而具有潜在的抗源性。为了解决这一问题，可以尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化；也可通过对活性中心糖基化位点的突变改造，消除糖基化；还可共表达糖链加工酶，是糖链结构更接近哺乳动物，从而降低免疫原性。
1．4．4 提 高产物的稳定性
高目的蛋白的稳定性，使之免受蛋自酶降解的常用方法有：在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，增加蛋白酶的底物以减少目的蛋白的降解因毕赤酵母可在较宽的pH范围内生存，可调节培养基的pH值抑制蛋白酶活性；使用蛋白酶缺陷型菌株，如 SMD1163、SMDll65、SMD1168。此外，可通过共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性，也可尝试将目的蛋白连接上一个过氧化物酶体靶向信号(PTS)，使其被分拣转运如过氧化物酶体贮存起来，免受蛋白酶降解，还可减少对宿主细胞的毒害作用。
2 丝状真菌表达系统
由于酵母是比较低等的真核生物，它对分泌蛋白的修饰度一般很高，而且修饰模式也与高等真核生物有很大差别。因此在酵母中，异源蛋白的表达相对是比较低的。丝状真菌可以弥补细菌和酵母的不足之处。丝状真菌既可以大量分泌各种酶蛋白，如Trichoderma reesei生产纤维素酶，产率达40 g／1。另外，丝状真菌的蛋白质糖基化模式与高等真核生物的模式非常相似，而且，丝状真菌的发酵工艺及下游加工技术也发展的比较完善。另一个优点是丝状真菌的新型的生物合成能力及有效地分泌机制，能使人们得到大量胞外生物活性蛋白，通过增加拷贝数及活性改造方法，扩大传统突变和选择方法，提高了工业生产菌株生产能力。
2．1 丝状真菌的转化
1979年报道了丝状真菌的第一例基因转化，一些主要的真菌，包括不同的接合菌、子囊菌，担子 菌和一些低等的真菌都能被转化。转化是真菌研究中重要的组成部分。转化方法如下：(1)原生质法转化，使用多种降解细胞壁的酶处理真菌细胞来制备原生质体是转化中最常用的方法。(2)醋酸锂处理法，用高浓度的Li+来使细胞壁吸收DNA，不用制备原生质体。(3)电转化法，丝状真菌的电转化基本上有三种方法：第一种方法是使用使细胞壁敏感的试剂处理菌丝；第二种方法是使用原生质体转化；第三种方法是电转化萌发的菌丝，需要处理菌丝，电转化是丝状真菌应用最广泛的一种方法。 (4)基因枪法，这种方法是使用Tungsten particles包裹DNA，转入完整的、厚壁的丝状真菌细胞(包括真菌的菌丝和孢子)。
选择标记有三类：(1)营养缺陷性互补基因包括argB，pyrG，trpC，riboB，pyroA，met，le等。由于其分离较困难，应用受到局限。(2)碳源氮源、硫源利用基因，包括amds，niaD，sC等。由于含有amdS(编码乙酰胺酶基因，来源于Aspergillus nidulans)的菌株能在含有乙酰胺的培养基上生长，而其野生型不能在含乙酰胺的培养基上生长；其次，以基因为选择性标记，转化DNA向宿主染色体中的整合基本以同源整合为主。(3)抗性基因，包括G418，Hygromycin，benA，oliC，Bleomycin，Phleomycin等的抗药基因。这是一类使用十分方便的显性选择标记，无需筛选突变株作为受体。取自原核生物的抗性标记有Geneticin和潮霉素B，取自丝状真菌的抗性标记有寡霉素抗性等．
一般说来，丝状真菌可高效率转化同源和非同源的序列使其整合到基因组上。丝状真菌一个有用的特征是能与不带选择性标记的质粒高效率的共转导(30％～90%)，而且可以获得高的整合型拷贝数。真菌转化系统的主要目标是产生真正的自主复制载体产生高的转化率和产生穿梭载体，但在真菌中很难找到自主复制序列和着丝粒序列．
CBH表达系统及rDNA整合序列
最好的产纤维素酶的里氏木霉缺陷菌株在适当的培养条件下每升分泌 40 g纤维素酶，这占总蛋白的5O％。而分泌的纤维素酶60％是CBHI，它是由单拷贝的cbhl基因编码产生的，因此可以说有一个强的启动子启动占分泌蛋白30%的这种酶的合成．而且CBHI蛋白N段结合多糖的糖基化形式与一些发现的哺乳动物细胞高含量的甘露糖类型相似。因此使用表达系统可以在木霉中高效表达同源和异源的蛋白。(1)表达异源蛋白。Harkk等人分别构建了四个表达质粒，将不同的牛凝乳酶的CDNA构建到cbhl的启动子和终止子之间．融合了cbhl信号序列和牛凝乳酶原CDNA，cbhl启动子和前牛凝乳酶原编码序列等，发现包含CBH成熟肽前20个氨基酸的与凝乳酶酶原融合，并且具有选择性标记amdS的产量最高。(2)通过改变启动子表达同源基因。有人将egll cDNA插人cbhl表达系统，与amdS共转化，产生比出发菌株高的内切葡聚糖酶的活性。这些结果表明，利用基因工程可以调整里氏木霉的基因表达，产生新的具有理想酶组成的菌株。
丝状真菌转化效率非常低，最常用的方法是利用同源重组系统。转化系统用含rDNA载体。这些研究的目的是增加真菌基因组中特定整合位点的质粒拷贝数。一般说来，转化效率提高了，就会出现rDNA序列引导的外源DNA同源整合人染色体组。近来，有人用ITSI-5.8s-ITSII rDNA序列，并且使用包括这个rDNA的PSP1。使用这个载体可大大提高转化效率。用不同的限制酶Southerblot分析转化子证明，载体整合入受体染色体组整合的拷贝数从1到高度重排的着丝序列数．Ja等人用包含18s rDNA的质粒转化酵母Phaffirhodozyma，在染色体上的rDNA位点也获得了多拷贝的转化的质粒。搜索更多相关主题的帖子:
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