我想利用长RT-PCR技术克隆10Kb的基因，利用的酶是TaKaRa的LA Taq酶，但跑了几次都没跑出来（附几次的电泳图，最后一张是我那cDNA的电泳图），请帮分析下是什么问题，是不是反转录的cDNA不完整啊？该如何检测？谢谢

前两张图是什么内容?第三张感觉好象降解了.

反转录后，cDNA不扩PCR跑电泳是看不出来的

我有反转录的cDNA也就是上面第3图的样品扩增，别人已经扩的基因片段（图如下）我扩出来了！但为什么我想扩全长扩不出来？条件是说明书上扩35Kb的噬菌体的条件！

前两图是我跑LA-PCR的结果，但都不是我想要的啊！最下边是引物二聚体吗？谁有跑LA-PCR的经验，帮下忙 快过年了 谢谢大家了

扩增Lamda噬菌体的条件并不一定适用于你的PCR扩增。

长片段扩增很复杂的，扩增不出来是很正常的，要有耐心。

建议你从下面几个方向进行尝试。

1，RNA提取过程中，应避免RNA降解，提取产物添加RNA酶抑制剂。分装后，－20或者-70冻存。RT时，采用高效的逆转录酶，例如invitrogen的SuperScript III等。如果不放心，可考虑在基因中间位置再设计一条逆转录引物，RT时一并加进去。

2，你采用的条件应该是94－68两步循环吧，可以考虑在循环参数上多尝试，
例如：
计算下最适Tm值。
94 4min，（94Cx30s－Tmx30s-72Cx10min）x30－72Cx10min
or
94 4min，（94Cx30s－Tmx30s-68Cx10min）x30－72Cx10min
or
94 4min，（94Cx30s－Tmx30s-72Cx10min(每个循环增加10～20s)）x30－72Cx10min
or
94 4min，（94Cx30s－68Cx10min(每个循环增加10～20s)）x30－72Cx10min
or
94 4min，（94Cx30s－60C(每个循环增加1C）30s-68Cx10min）x10－（94Cx30s－68Cx10min(每个循环增加10～20s)）x25－72Cx10min

3，看下GC含量，考虑采用高GC buffer。

4，引物多长，如果少于25nt，可将其延长至35－50nt

5，重新设计引物。

引用:

原帖由 jackey 于 08-1-24 17:14 发表
反转录后，cDNA不扩PCR跑电泳是看不出来的

不会吧？

为啥“反转录后，cDNA不扩PCR跑电泳是看不出来的”？请赐教！