在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略

    本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表。国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因。我们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全面的总结，以期有助于我国在这方面的研究。

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        （摘）总结
一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。其他的元件包括转录和翻译增强子等。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。我们在综合国内外研究的基础上，对有可能影响E.coli中蛋白质高效表达的多种因素进行了总结。尽管目前在E.coli中表达外源基因方面已经有许多重大进展，但仍有许多问题亟待解决。归纳起来主要有以下几点：
1．        借助于细胞的分子伴侣机制来提高正确折叠的蛋白质的产量。或许可以通过共表达多种分子伴侣编码基因和通过激细胞内众多不同的分子伴侣的方法来实现。
2．        在E.coli中表达真核膜蛋白和多亚基蛋白质复合物的难题上有待解决。
3．        蛋白质分泌到培养基中的真正和有效机制需要明了。目前已经有多种体系能够是重组蛋白质分泌到培养基中。其中有些是利用信号肽、融合伴侣和具有穿透能力的因子，这种因子能够引起外膜的破坏和有限的渗漏。而另外的策略是利用已经存在的分泌通道，来保证更高特异性的分泌。有关这方面的工作需要对E.coli中众多分泌通道的更多了解。
4．        赋予原核细胞诸如真核细胞那样进行翻译后修饰的能力。例如糖基化、磷酸化、乙酰化和酰氨化等。可以通过将合适的真核细胞酶类转入E.coli中而达到这些目的。
总之，E.coli作为一种原核表达系统具有多方面的优点，加之在许多技术方面的众多重大进展。E.coli仍然是基础研究和商业生产重组蛋白质的强有力工具。

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