影响毕赤酵母P．Pastoris中外源蛋白表达的因素

    虽然许多蛋白质在P.Pastoris中可高效表达，如明胶表达量高达14.8g／L，但仍有一些蛋白质表达量相对较低，如3-cryptogein表达量约为1~5mg／L。同一表达系统，对于不同的外源蛋白，表达量千差万别。一方面是外源基因序列本身的内在特性起着很重要的作用；另一方面，表达条件对表达量高低的影响也极其显著。
1.外源基因的内在特性
    1．1 5'-UTR的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。适当长度的5非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译。UTR太长或太短会造成核糖体40S亚单位识别的障碍。A0Xl基因5玎R长为114nt，并富含A+U，因此对于最佳蛋白的表达量，维持外源基因mRNA5-UTR尽可能和AOX的mRNA5一UTR相似是必需的，最好保持二者一致。这种方法使HAS表达量提高了50倍。
    1．2 A+T含量过高的基因在P．Pastoris中表达有时会造成转录提前终止。共有序列AT—TArIv1_rATAAA就是一个转录提前终止信号，还有一些未确定的转录提前终止信号存在于AT富含区。控制A+T含量在30％～55％。使破伤风毒素C片段得到高效表达。
    1．3 低频率利用的密码子：通过对110个酵母基因使用密码子的统计分析，确证了密码子的嗜好性与基因表达量密切相关L26J。在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。在所有的61个密码子中有19～25个是酵母所偏爱的。高表达的基因几乎毫无例外地使用这25个偏爱密码子。P．Pastoris表达植酸酶时，把酵母中使用频率为零的精氨酸密码子突变为使用频率较高的密码子，表达水平提高了37倍。
    1．4 外源基因的长度，直接影响其转化率，当外源基因大于1kb时，转化率大于50％；外源基因小于0.5kb时，转化率猛降至小于0.1％。

2.表达条件
    2．1 裁体的选择一般选分泌型、高拷贝标记，易操作的穿梭载体。绝大多数情况下，P.Pastoris中整合多拷贝编码重组蛋白的基因会提高重组蛋白表达产量；但也有例外，甚至反而会下降，因此，有必要选出高拷贝的同时，选一单拷贝进行比较表达。
    2．2 茵株及其表型一般首选蛋白酶缺失型菌株。对于分泌表达，Mut和Muts无明显差别，但在高生物量的发酵中，Mut生长更快，较之Muts对于提高外源蛋白的产率更有效。
    2．3 表达盒整合位点重组表达载体经酶切线性化后，含外源基因的部分称为表达盒(cas—settes)。表达盒中的AoX1位点和His位点是同源整合区。这两个整合位点并无区别。极少数情况下，在His位点整合时，染色体突变的His位点和表达盒的HIs4基因位点之间发生基因交换会导致表达盒的丢失，故一般优先选择A0X位点。
    2．4 通气量充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达量极其重要。增加通气量的措施有培养基体积不超过摇瓶体积10％~30％，把摇瓶斜置于摇床上，提高摇床转速等。
    2．5 培养基如BMGY/BMMY，BMG/BMM，MGY等都可用来表达。BMGY/BMMY，BMGMM培养基成分中含有缓冲液，常用来表达分泌蛋白，可在一个广泛范围内获得最佳的蛋白产量，尤其是当pH对外源蛋白活力重要的情况下。培养基中的酵母膏和蛋白胨，可作为富营养物，使菌体更好地生长，从而导致总的蛋白量增大。
    2．6 蛋白酶表达的外源蛋白对蛋白酶的敏感与否也影响蛋白的产量。通常是调整pH改变酶活性；培养基中添加1％酪氨酸蛋白水解物；使用蛋白酶缺陷受体菌SMDl168，有报道使用SMD1168比使用GSll5表达量提高2倍。
    2．7 甲醇含量一般每天添加到培养基中的甲醇含量为培养体积的0.5％，但在表达GA时，甲醇含量为O．75％时表达量最高，超过或低于该浓度都会导致表达量的下降。而Mut代谢甲醇的能力强，有研究者每天添加甲醇到3％，无不良影响。
    2．8 诱导前OD值P.Pastoris中蛋白表达分二个阶段。首先是在含甘油培养基中生长菌体，达到一定OD值后离心而得菌体，然后把菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达。理论上，OD值越高，生物量越大，则总的表达量也越大。但OD值越高，培养基中氧和营养供给越受限制。事实上高细胞密度不一定有利于外源蛋白的产生，这有赖于所要表达的外源蛋白的性质，如溶解性、稳定性、毒性等。影响外源蛋白在P.Pastoris中表达的因素是多方面的。许多因素对蛋白表达量的影响是巨大的，有时仅仅改进其中一个或几个方面不一定有明显效果，必须全面考虑各种因素。

请问楼主Muff是什么DD?