昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展
昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展
昆虫杆状病毒表达系统具有安全性高，对外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选，具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点，现已成为基因工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。近年来，昆虫杆状病毒表达系统的发展很快，本文综述了它的最新研究进展，并在此基础上分析其存在的主要问题和应用前景。
1．杆状病毒基因组的结构和功能研究
杆状病毒基因组为双链环状DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shapednueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。
目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV)、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV)、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。
目前AcMNPV基因组的研究最为深入，它是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。AcMNPV基因组的基因组织(geneorganization)较为复杂，基因组的不同区域具有功能分化，基因的分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等的重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间的不完整回文序列及其两侧各约20bp的序列构成。同源区是杆状病毒基因组普通存在的功能域结构，对于基因表达的调节具有增强作用，同时也是DNA复制的原点。
杆状病毒中现已鉴定的基因近70种，可分为结构蛋白基因和非结构蛋白基因两大类。结构蛋白基因如polh、P10、gp64、p6.9、gp41、vp39等基因。非结构基因中，与DNA复制相关的重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用的基因主要有ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。这些代表性基因与其功能的关系见表1。
2．昆虫杆状病毒系统表达外源基因的新进展
2．1杆状病毒载体及其表达系统进展
昆虫杆状病毒表达系统进行外源基因表达时，存在的一个问题是筛选带有外源基因的重组病毒的效率较低(最初仅0.1％～1％)，而且产物较难纯化。为此，人们设计了各种方法来改进病毒载体，如NPVDNA线性化，体外定点酶促重组，以及酵母-昆虫细胞和大肠杆菌-昆虫细胞的穿梭载体的开发等。其中Posse等设计的重组-救活可线性AcNPV病毒载体BacPAK6的重组效率较高，高达80％以上，具有重要的应用价值。该重组技术的基本原理为：先找一个在AcMNPV基因组中不存在的Bsu36I酶切位点，采用体外突变，在多角体基因两侧的非必需基因ORF603基因和必需基因ORF1629基因中各引入一个Bsu36I位点，然后通过重组将突变了的由ORF603基因、多角体基因启动子控制的半乳糖苷酶基因、ORF1629基因引入AcNPV基因组，获得重组病毒载体BacPAK6。(BacPAK6)DNA经Bsu36I酶切而破坏了必需基因OBF1629，因而靠自身环化不能成活，必须与携带多角体蛋白基因启动子控制的外源基因和OBF1629基因的转移载体发生重组，病毒才能复制而救活，因此，该法的重组率很高。这一系统现已扩展到了BmNPV表达系统。易咏竹等副通过克隆的家蚕核多角体病毒解螺旋基因DNA，与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒(BacPAK6)DNA在昆虫细胞中发生重组，经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf-21的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体(HyBacPAK6)，它与含植酸酶基因的转移载体Pvl1393phy在家蚕细胞中的重组率达90％以上。
此外，Bac—to．Bac表达系统是效率很高的表达系统，它利用穿梭质粒bacmid在大肠杆菌中高效复制后，再提纯用于转染昆虫细胞，大大缩短了时间。王汉中等根据BactoBac表达系统的基本原理，也构建了一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统(HaBac—to—Bac)。该系统中供体质粒pFastPhP10中插入了带有多角体启动子序列的完整的多角体蛋白基因，因而多角体蛋白基因的表达和包涵体的形成也可作为转染成功的重要识别标记等，这是商品化的AcBac—to．Bac系统所不具备的。
目前可被应用于昆虫杆状病毒表达系统的细胞系较多，但应用较多的细胞系是秋粘虫s.frugiperda卵巢组织的细胞系sf-9，以及家蚕细胞系。洪华珠等建立了一株高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系HNU—Tn.FB1。它是粉纹夜蛾Trichoplusiani脂肪体的传代细胞系。在辅以5％胎牛血清的商品无血清培养基Excell400中，该细胞群体的倍增时间为22.9h，最高密度可达2.2×106／ml，表达由AcMNPV构建的重组p.半乳糖苷酶的水平达(225.5±13.4)IU/ml。该细胞系在表达重组蛋白方面与目前商业上最好的“高五”细胞(BTI．Tn．5B1-4)相当，是一株很有价值的细胞系，具有广阔的应用前景。
另外，一些影响杆状病毒系统表达外源基因产物的因素在近两年得到了研究。杆状病毒吸附宿主细胞的动力学参数是影响细胞感染效果和表达物产量的因素之一。Petricevich等以表达轮状病毒的重组蛋白VP4为例，对病毒吸附动力学的参数进行了研究，发现影响细胞感染效果的主要参数是胎牛血清浓度。不用胎牛血清或经高温处理后再使用，反而可以获得更高浓度的表达产物。重组病毒感染sf-9的效果与细胞周期有关，Saito等对GFPuv基因在杆状病毒系统中表达的研究表明，当在宿主细胞的G.期感染时，细胞内的荧光强度是在G2／M期感染的1.3倍，同时在宿主细胞的G。/S期感染时，感染量是在G：/M期感染的1．5-1．8倍。该研究结果对于选择病毒感染宿主细胞的时期有一定的借鉴意义。01ejnik等讨论了高渗透压对昆虫细胞表达重组蛋白产量的影响。采用补料分批培养发现，TrichoplusianiBTI.TN.5B1-4(Tn-5)细胞具有很强的耐高渗透压能力，表达的重组核蛋白产量比等渗环境下的高出72％。该结果对于提高重组蛋白的产量具有重要意义，可能的原因是高渗透压下，葡萄糖的比耗率增加，细胞内重组蛋白的合成代谢更加旺盛。另外，杆状病毒易被紫外线钝化，Dustin等将海藻病毒的嘧啶特殊二聚物糖基化酶(CV．PDG)用杆状病毒(AcMNPV)表达后，发现重组AcMNPV受紫外线钝化的影响比野生型降低了3倍。该研究为提高杆状病毒抗紫外线能力提供了一个可行的办法。
2．2杆状病毒表达系统的最新应用
杆状病毒表达系统由于对外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选，具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点，现已广泛用于一些在其它表达系统表达有困难的高价值蛋白质的表达。新近报道的如人骨骼肌基因突变而产生的a-辅肌动蛋白，一直未找到较好的系统来表达它。Akkari等首次采用杆状病毒系统实现了它的高效表达和纯化。钙运转调节肽(caltfin)在动物授精过程中可以抑制钙流人精子，避免过早地产生顶体反应而导致授精失败。目前获取它的唯一方法是从动物体内提取，但如能通过生物技术手段大量生产，无疑具有广阔的应用前景。Phan等首次用昆虫杆状病毒系统高效表达了cahrin，并筛选出了有效的纯化方案。新近用杆状病毒表达系统表达成功的其它一些高价值蛋白见表2。
3．昆虫杆状病毒系统的应用展望
由于昆虫杆状病毒表达系统独特的性质，现已被广泛应用于药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域中。近几年的研究发现，AcNPV病毒也可以将外源基因导入哺乳动物的细胞，如人的肝细胞。这意味着AcNPV病毒可能成为哺乳动物基因治疗的媒介载体，因此杆状病毒有望在未来人类的基因治疗中得到应用。
另一方面，利用昆虫杆状病毒系统进行重组杆状病毒杀虫剂的研究也仍然具有十分重要的意义。由于昆虫杆状病毒对人、畜安全，不易引起广泛规模的生态平衡的破坏等特点，昆虫病毒杀虫剂已成为当今生物农药研究与开发的热点。但野生型杆状病毒有必要进行重组改造，因其杀虫速度较慢。此外，昆虫杆状病毒系统本身及其相关技术尚需进一步完善和提高。如该系统无法进行连续性表达；糖基化方式与哺乳动物细胞存在一定差异，糖侧链甘露糖的成分较高，而复合寡糖缺乏。在杆状病毒系统的基础研究和应用技术方面，目前杆状病毒的基因组学，特别是功能基因组学的研究相对薄弱，有关病毒晚期基因的高表达和调控机制等仍不明了。另外杆状病毒可能的其它宿主还不十分清楚，表达产物的纯化和多元表达等方面的技术还不够理想等，都需要今后进一步研究。当前应重点加强杆状病毒的基因组学，特别是功能基因组学的深入研究，一是有助于杆状病毒载体的进一步改良，二是随着一些调节外源蛋白表达的基因结构和功能的深入了解，有利于外源基因的高效表达和调控。
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