鉴于现在金属鳌合层析技术在重组蛋白质实验中运用相当广泛，而很多情况下实际效果并不如期望中那么高，所以设专贴供集中讨论用。提问答复请跟贴，希望酷友们各抒己见，热烈讨论。

[ 本帖最后由 nano 于 08-1-18 21:28 编辑 ]

2楼留用作为索引贴，专门提示重要回帖及一些资源贴，请超管与hamye协助管理，谢谢！

1.5楼 GE Healthcare的指导性文章：Addition of imidazole during binding improves purity of histidine-tagged proteins
2.有关NTA类填料，可以先看QIAGEN的说明书A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged protein，非常有帮助，已上传至FTP。http://www.genecool.com/bbs/thread-2408-1-5.html
3.Ni-NTA superflow cartridge说明书http://www.genecool.com/bbs/thread-10076-1-1.html
4.围绕HIS-TAG原核表达王牌之选--QIAGEN篇http://www.genecool.com/bbs/thread-15912-1-1.html
5.6楼IDA与NTA两种基团的简单介绍

[ 本帖最后由 nano 于 08-4-25 23:42 编辑 ]

留用

金属鳌合层析确实是个非常方便的工具，短小的标签（6-10个连续HIS）可以帮助方便纯化重组蛋白，因为HIS在天然蛋白中属于丰度相对较低的AA，所以一般情况下宿主的背景蛋白中干扰较少，这样在运用咪唑作为竞争物时，可以利用其浓度差异来分离目标蛋白与干扰蛋白。
从原理上看，这项技术相当完美，因为HIS富集的TAG与天然蛋白序列相比，在与一些二价离子的结合力上有动力学上的明显优势，只要调整竞争物梯度即可得到高纯度的目标蛋白。可是，很多人在实际操作中却得不到满意的结果，为什么？
这里说一下我个人的感受，首先，无论IDA还是NTA，都需要先固定在某种介质上，也就是所谓的母体，母体的选择对于填料合成非常重要，选择不当会带来相当多的感染因素，例如：离子力（母体带有一些电离基团能与蛋白质结合）、疏水力（去除母体离子基团则又使母体过于疏水，一些蛋白的疏水区又爱结合到母体上）、过小的孔径（在合成和交联的过程中使母体的孔径处于某种能阻滞蛋白的区间上）........所以、商业化填料都列出了最佳的工作溶液，其中的盐、缓冲液就是用于减小这些干扰因素（详细见各种说明书）
另一方面，许多人都喜欢盲目照说明书操作，通常说明书里都列出了示例洗脱步骤，可是在实际操作中都显得过于简单，例如：QIAGEN公司的NTA填料，说明书上一般都说WASH BUFFER一般洗3-10个CV即可，但相信大部分人这么操作得到的洗脱物纯度都会低于50％，WHY？因素很多、蛋白质这个东西可是龙生九子、个个都不一样的，什么不一样请看基础书籍，这里不详谈。到底怎么解决这个问题呢？无非是加大WASH强度，分为两条路1.加大WASH　BUFFER的体积；2.加大WASH　BUFFER中的竞争物浓度，或者说运用梯度WASH，这样都会有好转。不过，很可惜的是，就算这样，虽然在相当多的例子中可以达到色谱纯或CE检测几乎无杂质，还是不能保证每个蛋白都能做到70％以上的纯度，这一点上奉劝大家做好心理准备。
PS：说一下很多朋友不理解的问题，同样的WASH体积，每次做出来的效果不一样又是为什么？这里很可能出现的问题是，每次使用的WASH速率（线速度）不同，线速度不同所以单位体积WASH BUFFER效果也不同。而不同的填料，用什么样的速率，请大家仔细看看说明书，这一点非常重要。
以上说的只是个人的体会，主要为了抛砖引玉，希望有更多人能说出自己的体会，参与讨论。

我也添砖加瓦拉。
介绍篇GE Healthcare的指导性文章：Addition of imidazole during binding improves purity of histidine-tagged proteins
较常用的提高纯度的方法，即在binding buffer中加适量咪唑。

固定化金属离子亲和层析（IMAC）首次用于纯化蛋白质是在1975年（Porath et al.1975）使用亚氨二醋酸配体鳌合物（IDA,图4）。亚氨二醋酸（IDA）中充满金属离子例如：Zn2+,Cu2+,或Ni2+离子，然后用于去纯化各种蛋白质和肽段（Sulkowski 1985）。IDA只有三个金属鳌合位点并且不会紧密结合金属离子。弱的结合力导致在洗脱阶段时金属离子可以很容易的浸出而与目的蛋白和肽段紧密结合。这样导致分离蛋白产量低，产品不纯，及金属离子污染.
    氮基三乙酸（NTA），是由QIAGEN公司独家生产，由Hoffmann-La Roche改进的四齿状的鳌合物吸收剂，它能够克服以上的缺点。NTA（图4）能够占据镍离子配位基的六个结合位点中的四个位点，其余的两个位点可与六联组氨酸标签相结合（见图5）。NTA结合金属离子的能力要比其他可用的树脂鳌合物（Hochuli  1989）要稳定的多，并且能够在各种条件下保存离子，尤其在强洗脱的条件下。这种独特的，首创的NTA基质填料比IDA填料更紧密的与六联组氨酸标签相结合，其能够一步从不到1%的蛋白总量中纯化制备出多于95%的目的蛋白（Janknecht et al.1991）.
ps:翻译工作正在进行中，期待完成后和大家一起分享 ！

呵呵,两位斑竹的提议不错,这确实是一个很热门的话题,不过似乎有点过热了,就像目前的股市.
相信每一个经常接触Ni柱的朋友都有过类似的感受,可能正因为亲和层析专一性的原理和偷懒性的操作的诱惑吧.谁不想一步到位,一劳永逸,问题正如nono斑竹形容的:一龙生九子,个个不一样.从来都不可能有一种完美的方法适合于所有的蛋白质.
个人觉得蛋白表达和纯化是一种艺术性很强的工作,如果你超越了你所研究的蛋白的性质去寻求纯化的方法,似乎有点本末倒置了.现在我纯化蛋白首选的方法就是离子交换,其次才是辅以其他类型的方法,我觉得Ni柱结合离子交换效果不错.
Ni柱纯化,完全照说明书做是不行的,也必须像做离子交换那样采取梯度或者是阶段洗脱的方法,摸索出符合自己蛋白的条件,可以肯定的说20mM的咪唑洗柱,然后直接250mM咪唑洗脱是得不到纯度很高的产品的.一般起码得到40-50mM洗柱(好象会损失一些目的蛋白),纯度才比较理想一些.当然了,条件摸得越精细越好.
感觉一个Ni 柱过下来,比离子交换还累!

changhai0302说得没错，纯化一个物质，首先是要弄清楚目的产物的性质，如果单想通过tag之类的达到目的，似乎有缘木求鱼的感觉（不知道这样比喻准不准确），很多时候不光求到了鱼，还有很多其他类似的东西。
亲和结合离子交换是比较理想的组合，当然还达不到目的，则考虑其他如疏水、反相等方法。
最近纯化一个蛋白，到最后两条带的时候遇到了困难，结束后把实验过程总结一下介绍给大家。呵呵，郁闷阿。

实际操作中会有很多问题的，根本没有想象中的那样，即使用梯度洗脱的情况下，也会有些杂蛋白无法去掉，如果象楼上各位所说的加多一步离子交换的话，那么请问如何来确定我的目的蛋白的等电点，还有我们引入离子交换的目的是什么，如果说金属亲和层析后仍有杂蛋白，那么我们就可能会考虑到是因为发生了共纯化所导致，要是再用离子交换的话，根据什么来区分目的蛋白和杂蛋白呢？
请问各位大侠有什么高见，对于这个问题我还是有些不明白！虽然离子交换和亲和的原理我都知道，但对于这个问题还是优点糊涂！谢谢！

呵呵，这个你可以了解一下离子交换的原理，等电点可以根据你的氨基酸序列用软件分析，如果不知道氨基酸序列，也可以用实验来确定。