[杆状病毒] 转染双启动子表达载体在昆虫细胞共表达人白细胞介素

转染双启动子杆状病毒表达载体在昆虫细胞共表达人白细胞介素

【摘要】　目的　通过体外表达rhIL-12，以供研究其在体内外的生物学效应。

方法　外周血单个核细胞(PBMC)、粘附细胞和人口腔表皮样癌细胞KB分别经SAC(含A蛋白的金黄色葡萄球菌CowanⅠ菌株)、IFN-γ＋LPS和PDBu(12，13-二丁酸佛波酯)刺激，以GIT(异硫氰酸胍)一步法提取细胞总RNA，经RT-PCR技术获取IL-12 P40和P35 cDNA，将两条基因分别插入双启动子杆状病毒转染载体pAcUW51的多角子启动子和P10启动子下游，构建真核表达载体pAcUW51/IL-12，与AcNPV共转染昆虫细胞Sf9，获取表达IL-12的细胞株，表达产物分别经SDS-PAGE，Western blot，ELISA和生物学活性鉴定。

结果　rhIL-12产物的相对分子质量(Mr)经SDS-PAGE和Western blot鉴定为67×103，表达水平为15.4～15.7μg/106细胞。MTT法检测IL-12表达产物促进NK细胞杀伤K562细胞的能力比对照可提高60%，刺激PHA激活的PBMC增殖的能力最高可达到58%。

结论　成功构建了双启动子杆状病毒表达载体pAcUW51/IL-12，获得了共表达IL-12 P40和P35亚单位的昆虫细胞株。

关键词：白细胞介素12；表达；杆状病毒转染载体

　　白细胞介素12(IL-12)主要是由抗原提呈细胞产生的一种异二聚体(P40和P35)细胞因子，能显著增强NK/LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的应答能力，诱导T细胞和NK细胞大量分泌IFN-γ，启动TH0细胞向TH1细胞的发育，在抗肿瘤、艾滋病等多种疾病中将发挥重要作用〔1〕。我们用SAC、LPS、IFN-γ和PDBu等刺激剂作用于外周血单个核细胞或口腔表皮样癌细胞株KB，成功扩增出IL-12 P40和P35 cDNA，并插入双启子杆状病毒表达载体pAcUW51,转染昆虫细胞Sf9，获得高表达IL-12的细胞株，现将有关结果报告如下。

　　材料和方法

　　细胞株、菌株与载体：人口腔表皮样癌细胞株KB购自中科院上海细胞所，K562、Raji和Sf9细胞为本室保存。E.coli DH5α和含A蛋白金黄色葡萄球菌为本室保存菌株，双启动子杆状病毒转染载体pAcUW51购自PharMingen，含多角体启动子和P10启动子，可同时表达两条多肽链。

　　引物设计与合成：根据文献〔2〕设计6条引物P1～P6，序列及扩增片段见表1，P1/P2引入BamHⅠ酶切位点，P4/P5引入BclⅠ酶切位点，由美国Verginia大学医学院高斌博士提供。

表1　IL-12引物序列

　　Table 1. PCR primers of human IL-12

　　主要试剂：限制性内切酶BglⅡ、BclⅠ、BamHI、EcoRⅠ、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、T4 DNA连接酶、MMLV逆转录酶等购自GIBCO公司，IFN-γ、LPS、PDBu(Phorbol-12，13-dibutyrate)等购自Sigma公司，TMF-FH昆虫细胞培养基购自PharMingen公司，IL-12 ELISA试剂盒购自R&D公司。

　　SAC的制备：含A蛋白金黄色葡萄球菌在LB斜面培养基上长成菌苔后，生理盐水洗出，甲醛固定，无菌生理盐水洗涤后，80℃ 1 h杀菌，沉淀用RPMI 1640配成2%浓度，应用终浓度为0.02%。

　　末梢血单个核细胞的分离与刺激：血站抗凝血经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(PBMC)，后者在塑料板中37℃ 1 h后，分离悬浮细胞(PBL)和粘附细胞2种，调细胞浓度1×106/ml。用SAC刺激时终浓度为0.02%，37℃作用24 h，用IFN-γ＋LPS刺激时，先用1 000U/ml IFN-γ预处理16 h，再加LPS 5ng/ml刺激4 h。

　　KB，Raji，K562细胞培养与刺激：3种细胞常规RPMI 1640培养后，调细胞浓度1×106/ml。加终浓度为100nmol/L的PDBu，37℃作用24 h。

　　总RNA提取和RT-PCR反应：收集上述细胞经GIT一步法提取总RNA，MMLV逆转录酶合成cDNA，以其为模板分别扩增P40和P35长链及短链，PCR反应体积为100μl，P40长链(1 003bp)扩增参数为94℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃ 2 min，循环30次，其它片段为94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 1 min，循环35次，末次延长72℃ 7 min。

　　P40和P35 cDNA序列测定：由上海基康生物技术有限公司完成。

　　IL-12杆状病毒表达载体的构建：P40(1 003bp)cDNA和pAcUW51经BamHⅠ酶切、低溶点琼脂糖回收相应片段，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α菌，提取质粒经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定，获得的重组质粒命名为pAcUW51/P40。再插入P35 cDNA，分别用BglⅡ酶切pAcUW51/P40，BclⅠ酶切P35 cDNA，回收相应片段，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α菌，提取质粒经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定(图1)。

　　图1　pAcUW 51/IL-12重组载体的构建

　　Fig 1. Map of recombinant hIL-12 plasmid construction

　　pAcUW51/IL-12共转染Sf9细胞：按PharMingen公司使用说明书进行，并以空斑法筛选阳性细胞株。

　　IL-12表达产物的鉴定：筛选的阳性细胞株经RT-PCR鉴定基因表达，SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白产物，ELISA测定IL-12蛋白含量。

　　MTT法检测IL-12表达产物促进PBMC体外增殖能力：PBMC经PHA作用48 h后，分离淋巴母细胞，调节细胞浓度为106/ml，加入不同稀释度的IL-12表达产物再作用48 h，MTT法检测增殖活性。

　　MTT法检测IL-12表达产物促进NK细胞杀伤活性：外周血单个核细胞经不同稀释度IL-12表达产物作用18 h后，以MTT法检测其杀伤K562细胞的活性。

　　结果

　　1.IL-12 P40 cDNA的扩增：PBMC和粘附细胞经SAC或IFN-γ＋LPS刺激后能扩增出P40短片段(417bp)，未扩增出长片段(1 003bp)，PBC经上述作用后长、短片段均未扩增出，KB细胞经PDBu作用后扩增出P40长片段和短片段，Raji和K562未扩增出任何片段(图2)，其中1 003bp cDNA经测序与文献报道序列一致。

　　2.IL-12 P35 cDNA的扩增：PBMC和粘附细胞经SAC或IFN-γ＋LPS刺激后能扩增出P35短片段(351bp)，粘附细胞尚扩增出P35长片段(676bp)，PBL经上述刺激后未扩增出P35片段，KB细胞经PDBu刺激后扩增出P35长片段及短片段，Raji和K562细胞未扩增出任何片段(图3)，其中676bp cDNA经测序与文献报道结果一致。

　　图2　RT-PCR扩增hIL-12 P40 cDNA的凝胶电泳图

　　Fig 2. Gel electrophoresis of RT-PCR products of hIL-12 P40 cDNA

　　Line 1: 100bp marker; Line 2: PBMC+SAC; Line 3: PBL+SAC; Line 4: adherent cells+SAC; Line 5: PBMC+IFN-γ+LPS; Line 6: Raji+PDBu; Line 7: KB+PDBu

　　图3　RT-PCR扩增hIL-12 P35 cDNA的凝胶电泳图

　　Fig 3. Gel electrophoresis of RT-PCR products of hIL-12 P35 cDNA

　　Line 1: 100bp marker; Line 2: PBMC+SAC; Line 3: PBL+SAC; Line 4: adherent cells+SAC; Line 5: PBMC+IFN-γ+LPS; Line 6: Raji+PDBu; Line 7: KB+PDBu; Line 8: adherent cells+IFN-γ+LPS; Line 9: Raji+PDBu; Line 10: K562+PDBu　　3.pAcUW51/P40的鉴定：pAcUW51/P40经PCR反应能扩增出1 003bp片段，经BamHⅠ酶切亦获得1 003bp片段，经EcoRⅠ酶切，正向连接出现5 643bp和1 100bp 2条带，反向连接出现6 083bp和585bp 2条带。

　　4.pAcUW51/IL-12的鉴定：在pAcUW51/P40的基础上，插入P35片段，经PCR反应获得676bp片段，经EcoRⅠ鉴定，正向连接出现5 000bp+1 786bp+60bp(电泳时不易出现)，反向连接为5 000bp+1 200bp+676bp 3条带。

　　5.IL-12表达产物的鉴定：经空斑法筛选出表达IL-12的阳性细胞株，PCR扩增确定有P40和P35基因表达。SDS-PAGE显示有相对分子质量(Mr)为67×103表达产物存在(图4)，Western blot证实其为rhIL-12，ELISA测定细胞中IL-12的含量为15.4μg～15.7μg/106细胞。

　　图4　重组hIL-12 cDNA共表达产物的SDS-PAGE分析

　　Fig 4. SDS-PAGE analysis of hIL-12 cDNA coexpression

　　Line 1: Sf9 cells; Line 2-5: Sf9 cells transfected pAcUW51/IL-12 from 1 to 4 days; Line 6: protein marker　　6.MTT法检测IL-12表达产物促进NK细胞杀伤K562细胞的能力：当效靶比为10∶1、IL-12作1∶10 000稀释时NK细胞的杀伤活性比对照提高60%，当效靶比为100∶1、IL-12作1∶100、1∶1 000稀释时，NK细胞的杀伤活性比对照分别提高55%和25%。

　　7.MTT法检测rhIL-12刺激PBMC增殖活性：将rhIL-12依次作1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀释，PBMC的增殖活性依次为24%、48%、58%、21%。

　　讨论

　　在迄今为止所发现的细胞因子中，IL-12具有独特的结构特点，为两条多肽链通过二硫链共价结合的Mr为70×103(P70)二聚体，其重链(P40)由306个氨基酸组成，包含10个半胱氨酸残基和4个潜在的糖基化位点，轻链(P35)由197个氨基酸组成，包含7个半胱氨酸残基和3个潜在的糖基化位点。为了克隆和表达IL-12 P40和P35基因，我们通过SAC和IFN-γ＋LPS分别作用PBMC、PBL和粘附细胞，应用RT-PCR技术，参考已发表的IL-12 cDNA基因序列，设计相应引物，结果从PBMC和粘附细胞中扩增出IL-12的2条基因片段，经PDBu刺激的人KB细胞也扩增出2条基因片段，可能由于不同细胞IL-12 mRNA的丰度不同，仅在KB细胞和粘附细胞中扩增出编码IL-12全长氨基酸的cDNA P40和P35，在PBL、Raji、K562细胞中未扩增出IL-12基因片段。

　　由于IL-12由2条多肽链组成，且含有较多糖基化位点，体外表达较为困难。杆状病毒/昆虫细胞表达体系是真核表达体系中较为先进的一种，由于杆状病毒基因组可在昆虫细胞内复制和转录，其巨大的DNA(80～200kb)复制后组装在杆状的核衣壳内，后者具有较大的柔软性，能容纳大片段外源DNA，杆状病毒体内高表达多角体蛋白和P10蛋白，其启动子具有极强的启动蛋白表达能力，被用来构建杆状病毒转染质粒〔3〕，我们选用PharMingen公司最新构建的双启动子杆状病毒转染载体pAcUW51，该载体以杆状病毒AcNPV多角体启动子为构建基础再插入P10启动子，可同时表达2条多肽链。但2个启动子下游均没有多克隆位点，其中多角体启动子下游仅有BamHⅠ插入位点，P10启动子下游仅有EcoRⅠ和BglⅡ插入位点(见图1)，而P40 cDNA中含EcoRⅠ位点，P35基因中含EcoRⅠ、BamHⅠ和BglⅡ位点。这样P40 cDNA只能以BamHⅠ单酶切方式插入pAcUW51，经EcoRⅠ鉴定获取正向连接重组载体pAcUW51/P40后，再以BglⅡ切成线性，同时将P35 cDNA经BclⅠ酶切(BglⅡ和BclⅠ粘末端匹配)，从而将P35 cDNA插入pAcUW51/P40，构建成功pAcUW51/IL-12重组载体，将该重组载体与Baculo GoldTMDNA共转染Sf9昆虫细胞获取了IL-12真核表达产物，经PCR、ELISA、SDS-PAGE、Western blot等方法鉴定后，证实表达产物为rhIL-12，Mr为67×103，但SDS-PAGE显示67×103为主带，未见明显P35和P40带型，估计完整蛋白未完全解开，与D′Anerea用CHO表达的产物相似〔4〕，其中原因有待进一步分析。进一步研究发现，该表达产物对NK细胞杀伤K562细胞有较强的促进作用，体外对PBMC也有较强的促进增殖能力，该表达产物的获取，为IL-12的免疫调控和抗肿瘤研究工作奠定了基础。

　　基金项目：山东省科委科技攻关基金资助项目(96314916)

　　参考文献

　　1，Lamont AG, Adorini L. IL-12: A key cytokine in immune regulation. Immunology Today, 1996, 17(5):214-217.

　　2，Wolf SF, Temple PA, Kobayashi M, et al. Cloning of cDNA for natural killer cell stimulatory factor, a herterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and natural killer cells. J Immunol, 1991, 146(9):3074-3081.

　　3，魏海明, 田志刚. 重组杆状病毒/昆虫细胞表达体系在肿瘤研究中的应用.国外医学肿瘤学分册, 1997, 20(6):283-287.

　　4，D′Andrea A, Rengaraju M, Valiante NM, et al. Production of natural killer cell stimulatory factor (Interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells. J Exp Med, 1992, 176:1387-1398.