我现在刚开题，实验做的很差，实在是郁闷，我把我遇到的问题列出来，希望大牛们帮我诊断啊！
我们实验室目前人很少，做的还都不一样，师兄师姐都被老板送到外面去了。
一、关于转化
1.LB配方中，1L的LB中，我发现有的地方写NaCl用10g,有的地方写用5g，用于蓝白斑筛选哪个更好啊，为什么？
（我自己做，发现差别不大）
2.关于琼脂粉的浓度，我之前总是养不出来，后来老板说降低琼脂浓度，降到了0.7%，果然做出来了。但是后来
我查资料后，发现1~1.5%效果最好，现在用1％的长的也不错。看来是我操作手法的问题。
3.长出来的菌落特别少，应该是转化效率很低的原因，我是按照42度热击90s，然后放冰上操作的。还有，我们那个
水浴锅不是很稳定，是否有影响？
二、关于酶切鉴定
1.因为对质粒提取比较有信心（其实是因为又摸索了好久，汗死，都不好意思说了，后来改进了方法），提取完就
直接酶切了。用EcoR1,我用的是T载体，promega的，在我插入的片段两端都有EcoR1的酶切位点，电泳以后，发现
A.有三条带，汗死，而且都比我原来纯化的片段大，约500bp  
B.有两条带，小的也比目的基因大
共同特征：质粒的片段特别的暗，很诡异吧？有的克隆的几乎没有样品，而是只有一个很清晰的条带，位置和我目的
基因位置接近。不知道为什么？

非常感谢！我觉得自己实在是太菜了！
还有，提取质粒
用异戊醇沉淀和无水乙醇沉淀哪个更好一些？
我只用溶液1,2,3，然后无水乙醇沉淀，70％乙醇洗，效果还蛮好的，主要是溶液2比较好，我新配的！
这样提的质粒是不是直接酶切不太好呢？

[ 本帖最后由 biofreshfish 于 07-12-11 22:19 编辑 ]

1，先请楼主修改标题，请按发帖要求撰写。

2，NaCl 5g即可，Na离子和Cl离子的浓度对于大肠杆菌影响不大，如果是加入葡萄糖这类的碳源就另说了。

3，平板的琼脂糖浓度不知原因，虽然会有所影响，但基本上可以忽略，不过不知道有没有菌的转化对琼脂糖浓度有特殊需求。

4，转化效率低，大多是转化操作的问题，你可以搜索下论坛相关的帖子。一般来说，如果做了对照，可以排除感受态细胞和平板以及培养基和其他试剂的问题。化学感受态对于大多数一般实验是足够了，但是有些情况下，例如一些特殊的菌，以及长片段的克隆等等，有条件最好采用电穿孔的方法，其效率一般是化学转化的10倍以上。

5，提取质粒时，如果乙醇去除不干净，则易影响后面的酶切效率。看你的情况，A似乎是空质粒，分别是超螺旋，环状和线性，B似乎是环状和线性。

非常感谢Jack
我先看看要求
然后马上修改

建议用T载体提供的对照练习一下转化和质粒提取鉴定等方法。如果对照都没有问题的话，你的操作应该是没有问题的。

琼脂1.5％正常
LB用10G氯化钠
你的片断是用EcoR1切吗？这样转化效率低是正常的

呵呵
我现在也做的这个东西
新手一个
有机会多多交流
qq:503799891

引用:

原帖由 吹不起的清风 于 07-12-11 23:30 发表
琼脂1.5％正常
LB用10G氯化钠
你的片断是用EcoR1切吗？这样转化效率低是正常的

哦，为什么转化率很低呢？
对，我是用EcoR1切的
上周末命名切出来了
测序居然不对
想要跳楼了
我作实验想前进怎么这么难啊

单酶双切的话，是不是你筛选到的是反向插入的重组克隆？

引用:

原帖由 Jack 于 07-12-17 23:17 发表
单酶双切的话，是不是你筛选到的是反向插入的重组克隆？

对，我是单酶双切
测序结果好像是空载体
可是明明切出来了嘛
唉

贴个图上来瞅瞅。