[抗原抗体] PHICAL TEST (Calprest) ----钙卫蛋白

PHICAL TEST (Calprest) ----钙卫蛋白
酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒说明书

实验原理：
0.1g粪便提取物与约5ml提取缓冲液混合，于密闭试管中放置30分钟，离心后用特殊酶免疫试验（ELISA）检测上清液中的钙卫蛋白（calprotectin），待测标本和标准品加入到包被有抗钙卫蛋白多克隆抗体的可分离条孔中，经孵育和洗涤后，标本中的钙卫蛋白（有很多抗原结合位点）结合到反应孔上，再与加入的免疫纯化酶标记抗钙卫蛋白抗体反应，结合的酶量与样本或标准品中的钙卫蛋白量成正比，可通过测定其催化底物反应后显色的深浅程度，利用标准品来计算待测物钙卫蛋白的含量。

检测限制：
检测敏感度为6.25ng/ml，相当于15.6mg钙卫蛋白/kg粪便，样本稀释度为1：2500。

试剂盒内容：
1.        微量测定板：8孔×12条，包被有兔抗钙卫蛋白多克隆抗体，加袋装干燥剂密封。
2.        酶结合物：15ml碱性磷酸酶标记物，为免疫亲和纯化IgG抗钙卫蛋白抗体（兔抗）
3.        底物液：1瓶15ml，直接使用
4.        洗涤液：50ml，20×浓缩，用蒸馏水稀释
5.        样品稀释液：20ml,10×浓缩，用蒸馏水稀释
6.        提取溶液：50ml，5×浓缩，用蒸馏水稀释，浓缩液对眼睛和皮肤有刺激
7.        标准品：5管1ml，已知浓度钙卫蛋白（6.25，12.5，25，50，100ng/ml），见瓶上标签
8.        质控1：1管1.0ml，不用稀释，直接使用，单位ng/ml，测值范围见瓶上标签

仪器准备：
1.        可任意使用的不易碎的无菌接种环
2.        可任意使用的聚苯乙烯螺旋帽的试管（14ml）
3.        Eppendorf 试管1-1.5ml
4.        敏感的数字称量仪（40-150mg）
5.        旋涡混匀仪
6.        振摇器
7.        微型离心机（10000g）
8.        冰箱（-20℃）

注意事项：
1.        该试剂盒仅供体外检测用
2.        检测前将试剂、样本和微量反应条孔恢复至室温（20-25℃）
3.        戴手套操作实验
4.        试剂盒中使用的人源性物质已被证实为HBsAg、抗HIVⅠ、抗HIVⅡ和抗HCV抗体阴性，但仍应将其视为具有潜在生物危害，按照实验室规定进行处理。
5.        警告：不要混用不同批号的试剂盒，只有使用同一批号的试剂才能保证满意的实验操作
6.        应在试剂盒的有效期内使用
7.        避免混用试剂瓶盖
8.        保持反应条孔底面干净，避免擦痕
9.        底物液含有低于0.1%的叠氮钠作为防腐剂，叠氮钠对水生生物有很高毒性，避免倾入排水沟。
10.        底物液应该是淡黄色，对光敏感，储存于暗处，使用前混匀。
11.        未使用的反应条孔应重新装入袋内封闭储存于2-8℃。
12.        ELISA板洗涤不充分，残留试剂可导致错误结果，建议常规维护洗涤系统。
13.        使用提取液时如溅入眼睛，立即用大量水冲洗并咨询临床医生
14.        使用提取液时穿合适的防护服
15.        除底物液和浓缩洗涤液外的所有试剂，含有低于允许量的Proclin 300防腐剂。


试剂工作液准备：
提取缓冲液工作液：稀释浓缩提取缓冲液1份（20ml）加蒸馏水9份（180ml），充分混匀
稀释缓冲液工作液：稀释浓缩稀释缓冲液1份（20ml）加蒸馏水9份（180ml），充分混匀
洗涤缓冲液工作液：用蒸馏水稀释整瓶内容物（50ml）至1000ml

试剂稳定性：
试剂        储存条件        储存时间
结合物        2-8℃        1月
底物        2-8℃        3月
标准品        2-8℃        1月
质控品        2-8℃        1月
洗涤工作液        20-25℃        7天
提取工作液        2-8℃        3月
稀释工作液        2-8℃        7天

1.        失效期打印在标签上
2.        避免暴露在高温、太阳直射或很潮湿的地方
3.        未使用的反应条孔密封于有干燥剂的袋内可储存1个月

粪便标本的收集和准备：
1.        收集大约1-5g大便于适当容器中，4天内送实验室检查，运送温度不超过30℃
2.        样本保存在-20℃，检测时室温解冻
3.        称空的带螺帽试管和接种环重量，用接种环取大约100mg（40-120mg之间）大便，放入带螺帽试管内4-6cm处，称重后计算出粪便净重（40 -120mg之间为宜）
4.        加入预先稀释的提取缓冲液（重量/体积=1:50），如100mg粪便+4.9ml稀释提取液，盖紧盖子
5.        用力振摇混匀30秒，置于振摇仪或旋涡仪上25±5分钟，置于里面的环可促进混匀
6.        吸取均匀混合物1ml到Eppendorf管，室温离心10000×20分钟
7.        吸取0.5ml清亮上清液到另一Eppendorf管，该提取物应立即检测或-20℃储存待测（最长保存3个月）

实验操作：
1.        确保所有试剂恢复到室温（20-25℃）
2.        冻存标本放在室温解冻
3.        稀释样本1:50（20μl样本+980μl稀释缓冲液），高浓度标本可稀释到1:250（如200μl1:50样本+800μl稀释缓冲液）
4.        建议做复孔，取所需反应条孔固定在架子上，如果洗板机要求整板，则用空白条孔填满96孔板，每次检测均应设空白孔、标准孔和质控孔
5.        按下表加样：
        1        2        3        4        5        6        7        8        9        10        11        12
A        空白        标准4        样本1        样本5        样本9        样本13        样本17                                       
B        空白        标准4        样本1        样本5        样本9        样本13        样本17                                       
C        标准1        标准5        样本2        样本6        样本10        样本14        样本18                                       
D        标准1        标准5        样本2        样本6        样本10        样本14        样本18                                       
E        标准2        质控1         样本3        样本7        样本11        样本15                                               
F        标准2        质控1        样本3        样本7        样本11        样本15                                               
G        标准3        质控2        样本4        样本8        样本12        样本16                                               
H        标准3        质控2        样本4        样本8        样本12        样本16                                               

6.        孵育到时，每孔加0.4ml洗涤缓冲液洗板，尽可能弃去液体，洗涤3次，最后在吸水纸上轻轻拍干
7.        每孔加入100μl酶结合物，密封纸封闭后室温孵育45±5分钟。
8.        重复洗涤过程（见6）
9.        每孔加入100μl底物液，注意：使用多头吸样器减少显色时间的差异，避免出现气泡
10.        室温避光（或用铝箔遮盖）孵育约30分钟
11.        用酶标仪在405nm波长下测定OD值。当标准品5 OD值达到1.2 -1.5，应立即用自动化酶标仪测定或加终止液1M NaOH 100μl终止反应，终止后可4℃保存24小时。

检测校准和质量控制
1.        每次检测均应做一条新的标准曲线
2.        板背景显色应<0.15 OD
3.        每次检测均应做质控1和质控2

结果计算：
计算所有复孔的均值，减去空白孔均值，以钙卫蛋白浓度（ng/ml）及对应OD值作曲线，待测样本可查曲线得到浓度值，校正稀释度（2.5）后得到浓度值（mg/kg）（例：读值50ng/ml，校正后实际为125mg/kg），如果稀释度更大则按实际稀释度计算结果，也可由自动化酶标仪计算得到。

参考值范围：
健康正常人均值：25mg/kg粪便
结肠直肠癌均值：350mg/kg粪便
炎症性肠病（CD/UC）均值： 1722mg/kg粪便

结果解释：
>50mg/kg为试验结果阳性
正常人均值约为25mg/kg粪便
结肠直肠癌患者均值约为350mg/kg，活动性的、有炎症症状的肠病结果在200-20000mg/kg之间。