载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。1 ]* |! ?5 r4 Y4 ~' _; y7 g( K
一、一个合格质粒的组成要素
8 Z$ i' { N4 t$ P8 V
& |1 k3 k+ X7 Q5 g' k7 |即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
- Z/ v9 M4 g. i5 f( A
1 R& i: W* W9 T D复制起始位点Ori
' o0 y% \% W- |* u5 \# F, ~
6 k. t6 j1 I( e,Kan+* C1 i' L- h/ o8 u/ e+ {
* W& h) [6 C9 X, d1 Y5 `
抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+8 O/ l. H9 G1 [5 o) Q
克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段. z* S2 k& x2 F9 P
/ u, b+ m, c4 o3 t* o: E+ z' n1 m/ n" }4 O2 D9 i2 M+ \! r4 o
5 T) b" L# n% e. g7 h G* L启动子/增强子l P/E8 |5 S: a# d* U( F4 C3 c
- u$ `" _# V$ T9 d0 m2 R
Terms 终止信号* G9 R& d) R, j4 ?/ R
2 `/ n: |, R; N" }+ |, c* f/ n. _可以起到稳定mRNA作用l( K* O5 S' @ g2 ?0 V
加poly（A）信号
/ h: s4 L: ?* [0 i: H7 Q- {( L8 l二、如何阅读质粒图谱
' N+ f5 u2 J+ w7 N; [3 {: O第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）* i3 W3 d& y- ~3 |) X
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。7 m( \8 l8 ?; x- E
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。; c' i8 _9 V' C. @ d! g P
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。4 T2 C/ L; _( }: m
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。( L* y8 t- z# G2 |# r# \; X/ s
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活
% b) P6 q: Q$ K M6 H9 y（5）hygr 使潮霉素β失活。
$ R: L' f# D* t2 O( G8 F第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
3 |9 I! _& M+ k% [# x; r第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。; s& N1 w! }7 g7 Z& p: S
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。! L* F# h$ u8 v* e% x A
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号, ?0 ?# u+ S T2 l9 n: g
l
, c0 }$ t8 z2 g3 p启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。8 e) c( ~$ E0 g1 n* E, a; U( v
基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。l
N$ n- ]6 L' I1 j# F/ f增强子/沉默子－为真核
$ l0 |. a1 `0 O0 ul
% j# h( J5 }2 I9 B3 N核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。
7 y, m! s% K; |% S% A4 s/ x转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰 区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富 l丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
% [; u4 ?3 I% L N% z/ @% O3 |回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.0 d/ R. c- {0 j5 l3 R2 d& o
" H6 {4 j/ s. Z# {$ L, U" A/ J
三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）/ Y) E& x3 G& D0 @! D% q
1. 什么是载体+ j/ g1 B0 b1 r! Y% a
即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。/ @" {! j( T7 H3 g6 W+ j6 j- U
P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA, A" C5 e" ?/ l( C2 w
1 g3 z7 t9 ?9 g* c2 f$ m" q/ B* y2. 载体的分类; [: @$ z6 {% J/ w& J# z
―――按功能分成：（1）克隆载体 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体）/ k, g: S! i% x( w$ ]
（2）表达载体 具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
5 T0 Z4 @- F1 a; a$ O; R―――按进入受体细胞类型分：（1）原核载体 （2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector） 指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.9 G* ^7 ]. u$ A
P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。
( D1 z) A3 i0 s9 W1 A' r$ P9 H+ v4 {# q- F* I
3. 基因工程载体的3个特点：
, F) i# y: L4 K9 l6 c（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。
' `0 [# n1 c1 y6 v; y: [（二）都能便利的加以检测： 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。$ O5 ~( E+ [: y
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。9 s( I$ ~! X% \( K
# \; ?! f+ x' q( K& R" s
4. 载体的选择和制备：+ I7 j0 }, Q) l7 D s# V% {
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 d* h6 H3 P: `$ L% v
载体选择主要考虑下述3点： {; A6 y9 N% V/ J1 S) E1 M
【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。( |: F+ f$ n6 n
【2】.载体的类型：
% Y6 h% o( g8 b* G2 d（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。- e; ~% \+ @& J6 o) W# u
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。$ T, R5 \* B6 z' z3 b
（3）对原核表达载体应该注意3点：3 N; [5 w+ o/ p; G- X
①选择合适的启动子及相应的受体菌；& n9 |/ P& Q8 N0 |4 L/ W
②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；' M5 y% j# B1 T- j/ W( F E. C p
③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
[% T$ o7 k* l ]. S' i6 c【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。1 V0 m9 a* _9 k1 ~' j. n" M
选用质粒（最常用）做载体的4点要求：& a/ r6 T1 R. m! ^
①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
$ ? d! t- v; f. \# L②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
3 M' ~6 W. H$ N5 z# X③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；5 u$ J5 O8 l# N9 G: ~
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。3 G7 d* k c, B8 k; K8 T" A" r
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接
