最近用HPLC分离鉴定蛋白
C18柱，70%甲醇水溶液洗脱，1ml/min流速，用200nm，210nm，225nm，280nm检测波峰，时间2h
发现在2-3min中处出现一正峰，随后有一个小峰，但是，后来30min左右出来个负峰，最后基线一直较高，没有降下来，直到最后
请大家多多指教，看怎么回事，第一次做什么都不懂！！

有以下几个方面提出来，供大家讨论：
1、不知道你具体的buffer比例？加TFA吗？可考虑用乙腈。
2、2-3min出来的应该是溶剂峰。
3、你的样品有没有问题？可跑个电泳看看。我以前做一个HPLC，结果很多小峰（样品放了很长时间了），后来跑电泳发现有降解。
4、HPLC一般30min走完差不多，2h明显长了。如果是这么长时间走完的话，那么就要考虑缓冲是不是有问题。
5、可考虑用5%到95%的乙晴或甲醇走个梯度，梯度的时间设为30min。

祝顺利。

首先谢谢hamye版主的指点！！
继续问几个弱智问题
1.为什么洗脱蛋白要用乙腈而不用甲醇？
2.为什么要加三氟乙酸？
3.为什么测蛋白吸收峰不用280nm而用210nm或者214nm等更小波长？
4.如果用70%乙腈和用50%乙腈那个先把蛋白洗脱，为什么？
5.如果在洗脱过程中出现负峰是怎么回事？
6.在HPLC过程中，会不会出现溶解蛋白的缓冲液中存在与蛋白相同吸收峰的物质？如果有怎么区分？
谢谢，请多多指教！！

回答楼上几个问题：
1、关于乙腈和甲醇的选择问题：在做HPLC时，并不是说一定要选择哪个。具体用什么试剂，要看洗脱下来的峰形，如果用甲醇时峰形不好，则可试用乙腈，反之。在其他方面，相对来说，乙腈的吸光度要小，故产生的噪声要小；乙腈做流动相时柱压较低；洗脱能力，乙腈也要强一些。故，比较言之，用乙腈做流动相比较普遍。
2、加TFA的目的：流动相中的三氟乙酸可以改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。也就是说跑出来的峰比较好看一些。一般加0.1%的TFA。
3、用214nm测的峰面积较大，而280测出来的要小得多。可以试一下看看。
4、70%快
5、这个要看具体情况了。可以在网上搜一搜。
6、不用考虑这个问题，你上样量只有几十ul，溶解样品的缓冲在前面两三分钟就会跑出来，就是所谓的溶剂峰。

TFA强效极化蛋白质
210用于检测肽（肽键），280检测蛋白（共轭双键），测蛋白时可以把两个通道都开着，哪个峰好选那个图
一般做液相都用梯度洗脱，你直接上70％甲醇洗脱，柱子上的蛋白可以一次被你全洗下来，所以你出峰时间很短
最后一个问题同上吸收波长的答案
液相做得不多，只能给你这些参考

HPLC分离鉴定蛋白使用的色谱柱填料的孔径需大于300埃，否则容易堵塞，自然无法洗脱出来，同时色谱柱也废了。

呵呵，一种未知的东西当然不能盲目上样，弄不好会在柱中沉淀。
在做HPLC之前，一般先将你的样品用100%的流动相试剂（甲醇或乙腈）对半稀释，过夜，看有没有沉淀。
如果有沉淀，就要考虑一下了。

哦，原来要考虑的问题这么多，以前没接触过，看了大家的建议真是受益匪浅，回来再仔细考虑一下，再有问题希望还能和大家交流

谢谢拉