[发酵工程] 在现存途径中提高代谢物质的流量的途径

在生物体内，对于某一特定产物的生物合成途径而言，其物质流量是一定的，增加目标产物的积累可以从以下五个方面入手。
1 增加限速步骤酶编码基因的拷贝数
将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加拷贝数，在宿主中表达以实现目的产物产率的上升。首先，必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。然后，将编码限速酶的基因通过酶切等手段，制得特定片段，连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达。在孢霉素Ｃ的发酵过程中，青霉素Ｎ的积累表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤，通过克隆编码限速酶脱乙酰基头孢霉素合成酶基因ｃｅｆＥＦ，再将该重组质粒导入头孢霉素Ｃ生产菌株顶头孢(Cephalosporium acremonium)中，所得工程菌株的头孢霉素Ｃ的产量提高了25%，而青霉素Ｎ的积累量减少了15倍。

2 改变分支代谢途径的流向
增加限速酶拷贝有时并不有效。通过提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，而保持其它代谢流量不变， 使其在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，可以提高目的代谢产物产量，往往更加有效。例如，芳香族氨基酸合成中，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三条支路上的任一条支路的酶活性被加强，其与另两条支路的竞争将占据优势，例如Ikeda等将Ｐｈｅ生产菌种的编码ＤＡＨＰ合成酶、分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶的3个基因克隆并连接在一起，然后转移到色氨酸(Ｔｒｐ)生产菌株中，使代谢流方向从终产物为Ｔｒｐ转向了Ｐｈｅ，Ｐｈｅ产量达到28ｇ/ Ｌ。
此外还可以通过去除导致副产物形成的整条途径，或者使得分支途径第一个酶失活的办法来实现。赖氨酸工程菌的构建是一个典型例子。众所周知，高丝氨酸脱氢酶缺陷型(Ｈｏｍ )突变株由于缺乏催化天冬氨酸半醛为高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶，因此丧失了合成高丝氨酸(Ｈｏｍ)的能力，从而使分支代谢流流向赖氨酸分支，通过克隆这一支路上的相关酶基因(如二氢吡啶 2，6 二羧酸合成酶基因)，所得工程菌可以积累大量赖氨酸。相反，如果将编码高丝氨酸脱氢酶(ＨＤ)的基因连接在多拷贝的载体质粒上并克隆化，使该基因进行扩增，则代谢流将明显转到合成蛋氨酸和苏氨酸的支路上。
3 强化以启动子为主的关键基因的表达系统
外源基因的高效表达往往需要一个强有力的启动子及其它表达元件。对于大肠杆菌受体细胞而言，携带强启动子的ｐＫＫ233-2和ｐＳＰ72等均是良好的载体质粒。重组质粒在受体中的拷贝数通常是恒定的，在强启动子的控制下，高效率的转录能合成更多的ｍＲＮＡ，并翻译出更多的目标酶分子。例如在混旋肉碱的生物转化过程中，将大肠杆菌来源的caiDE基因克隆在ｐＳＰ72的Ｔ7启动子下游，重组细菌即可合成超过野生菌株数百倍的转化酶，从而大大加快了Ｄ 肉碱转化为Ｌ 肉碱的速度。

4 提高途径激活因子的合成速率
作为激活因子的调节子是生物体内基因表达的开关，它的存在和参与往往能触发基因的正常转录，因此提高激活因子的合成理论上能促进相关基因的表达。对于能够生成多种次生代谢产物的链霉菌属，多效性调节子控制着抗生素的某些甚至全部生物合成途径。途径特异性的激活因子(activator)一般只控制某一种抗生素的形成。如有一种叫做srmＲ的调节基因(用来激活转录的蛋白质的基因)，这种调节基因在螺旋霉素(由Ｓreptomyces ambofaciens生成的一种大环内酯化合物)生物合成中的作用已得到认定[15]。借助一种多拷贝载体导入该基因，螺旋霉素的最终质量浓度从100μｇ/ｍＬ提高到500μｇ/ｍＬ。一种途径特异性调节子ccaＲ也已在Ｓreptomyces clavuligerus头霉素Ｃ的基因簇中得到认定。多拷贝质粒上该基因的额拷贝使得头霉素和棒曲酸的产量几乎都增加了1倍。

5 灭活途径抑制因子的编码基因
　除了途径特异性的激活子外，在某些情况下途径特异性阻遏子(repressor)也调节抗生素的合成，已被鉴定的包括：在Ｓ.coelicolor中发现的次甲霉素(methyleomycin)基因簇的ｍｍｙＲ和actionorhodin基因簇的actⅡ；在Ｓ.glaucescen中发现的四联霉素Ｃ(teracenomycinC)基因簇的tcmＲ；在Ｓtreptomycespeucetius中发现的道诺红菌素(daunorubicin)基因簇的dnrＯ；在Ｓtreptomyces venezuelace中发现的jadomycinＢ基因簇的jadＲ2等。例如调节蛋白ＭｍｙＲ参与途径特异性负调节，其失活可导致Ｓ.coelicolor中的次甲霉素过量合成。