各位好!!   
         我现在才开始做实验,遇到一个问题,希望酷友们指点指点.

  我准备在T-B-T基因 (其中T和B是不一样的基因,但是两端的T基因是一样的)

的两端加上新的酶切位点,我设计了5'引物和3'引物,用的是fermentas高保真酶,

用两个退火温度进行PCR,但是每次跑胶的结果显示,没有T-B-T的目标条带,

或者是很淡,但是T的条带很亮.

       请教各位,我应该怎么改进反应条件?或者怎么改进引物?

不同理解你的问题，你是用两对引物同时扩两个基因吗？两个基因的模板数不同，所以条带亮度肯定不同的。至于没有中间基因，我想应该是中间基因的引物设计的问题或者其扩增时候的退火问题出现问题吧？

你两端的T基因一样，那么你的引物可能只结合到其中一个上了，就是说两个引物从T-B-T两端可以结合，但是也可以只在T两端结合，而且这样结合的几率应该大于跟全体基因结合的几率。所以你的T条带会很亮。
以上为个人意见，不对之处请谅解

一楼酷友,我是用一对引物扩增的,

   二楼的朋友应该理解我的实验困难了,谢谢你们.

      我在想是不是应该在设计一队引物(就是在T与B交界处设计引物W1,和B与T的交界处设计引物W2),先把W1和W2先放入PCR反应体系,反应一段时间后.在放入以前的T-B-T的两端引物.这样扩增得到的长片段应该会多一些??

      不知道这样可不可行??  请教各位了

不太明白为什么要这样扩增，不过看到你写的第二个方案可以考虑用多重PCR，先将全部T-B-T段扩出来，然后再加入内引物扩需要的部分。另外，我觉得下游引物比较重要，直接影响你扩出来的是T还是T-B-T，建议下游引物设计的离第二个T远一点。

如果用两对引物扩增的话
开始应先加外引物，扩增一定循环之后
再加入内引物（w1\w2），进行扩增。

应该照5楼的方法做比较方便，有终止密码子，后面多一小段序列没有很大影响

谢谢谢谢呀    有了眉目再告诉大家呀