请问载体去磷酸化中有那些注意事项呢？怎么样才能使去磷酸化后自连情况最低？

好久不做去磷酸化了 ，感觉按照一般操作程序效果即可，呵呵，这个当时也没有好的方法评价其效果。

一般非单切连接或者双切酶不是同工酶的时候，不用去磷酸化，特异的连接效率会远高于非特异的自连。

所以最好的方法是设计的时候就尽量避免自连的情况。

，好像没怎么回答你的问题。汗。。

非常感谢您！我因为是单酶切，所以必须去磷酸化，由于连接转化后斑很少，就怀疑是去磷酸化过度了，因此很想了解一些大家是怎么去磷酸化的，想学学经验，呵呵......

转化得到的克隆少不单单是载体脱磷过度，有可能你的连接效率过低（连接时载体要100NG左右插入片段要摩尔数比载体多）或者你的感受态效率太低  做个阳性对照看看感受态效率 如果感觉脱磷过度可以在脱磷时做个梯度

脱磷过度的情况并不多见，如果连接效率低可以优化连接体系，载体和片段的比例1:3

去磷酸化，影响不影响连接效率我不知道，转化的点较少，那是一定的，因为去磷酸化往往不彻底，还需要进一步检测筛选，要有耐心多做几次，没问题肯定能连上的

谢谢各位了，我会根据大家的建议再多尝试一下

我刚做过,酶用的是老板从美国带回来的,国内的就不知道怎样.
有一点是肯定的,不能去磷酸化时间过长,一般37度30分钟即可.时间过长效率回很低