蛋白版有关蛋白质复性的问题比较多，蛋白复性也是一个比较复杂的问题。目前为止出现了很多的复性方法，这些方法也各有利弊，我希望能通过本文将自己接触到的一些文献和实验过程中碰到的一些问题同大家一起分享和交流。

资料一：Purification of (His)6-tagged recombinant proteins expressed as inclusion bodies in E. coli using a Ni2+-charged HiTrap Chelating HP column

简要介绍：如何利用亲和层析纯化和复性大肠杆菌表达的包涵体，介绍比较详细，文中有一些比较好的细节可以在实验中参考。
      本方法介绍了大肠杆菌表达的带His标签的包涵体蛋白Sm25和Sm29的溶解和纯化策略。重组蛋白首先用8M尿素溶解并通过His tag结合到镍柱上。然后通过尿素浓度的梯度降低以实现蛋白的柱上复性。
      文章的结论部分值得仔细思考，通过一根柱子，我们可以做些什么，除了蛋白的纯化和复性，在柱上进行切割也是很有价值的。当然这主要涉及到缓冲怎么处理。

07.12.5修改题目：讲复性就必然会涉及到纯化，所以感觉光说复性有点太片面，呵呵，所以改了个题目。

[ 本帖最后由 hamye 于 08-3-18 17:36 编辑 ]

好像是AMERSHAM的系统吧，不过这种说明书有着通用的意义，对理解改过程有帮助

对，文献介绍的是它的预装柱，不过这一类的填料都可以这样做。
我现在纯化的东西因为量都比较多，所以都是自己装的柱子。
效果还不错。

不过有点遗憾的是单纯用一根his柱不能纯化的很干净。
我考虑在柱上复性时进一步纯化。

资料二：蛋白质的分离、纯化和复性

作者：苏志国
作者单位：生化工程国家重点实验室、中科院过程工程研究所

主要内容：
1、蛋白质相关产业的国内国外发展现状，存在的问题；
2、提高蛋白质回收率的策略：操作优化、过程集成、纯化伴侣（这个好像以前没有接触过）；
3、蛋白质的重折叠（复性）：原理、手段、优缺点分析
4、层析复性及影响因素：多梯度
5、应用举例：人肿瘤坏死因子的分离纯化

引用:

原帖由 hamye 于 07-11-22 21:02 发表
对，文献介绍的是它的预装柱，不过这一类的填料都可以这样做。
我现在纯化的东西因为量都比较多，所以都是自己装的柱子。
效果还不错。

不过有点遗憾的是单纯用一根his柱不能纯化的很干净。
我考虑在柱上复性时进一步纯化 ...

很多人问Ni柱的效果，做法，怎么才能得到电泳单一条带的纯品。实际上纯化效果要根据具体蛋白而言的，很多情况确实是达不到高纯度，50％纯度都比较难，亲和柱也不是万能的，并不必执著一定能得到纯品。
现在只要是有较大表达量的(>5%)，一般我做出来都在60％以上纯度，一部分达到色谱纯，液相上没有明显杂带，但有的蛋白却怎么做都难得到纯品，分部收集几乎收不到一管是纯的。
进一步纯化我觉得可以考虑疏水，或后面跟脱盐+离子，这样一般都能达到高纯，只是很多实验并不需要那么纯，一些蛋白也经不起折腾就失活了，得不偿失。
以上纯属聊天，呵呵。

[ 本帖最后由 nano 于 07-11-22 23:04 编辑 ]

"只是很多实验并不需要那么纯"，我也觉得是这样，纯化一个目的蛋白，如果不是单纯为了练技术，达到需要的纯度就够了。比如如果是免疫动物，过一根柱子就足够了。过于认真，有时候费时费力。

嗯，有个专门做动物的老师说，多抗用70％纯度的抗原足以

呵呵，差不多，我们有时候把包涵体洗一洗就用来免疫的。

除了做western或标准原，一般都不用费力纯化。

呵呵，我也是这么觉得，多抗反正收到的血清有效抗体含量也不到总抗体5％，想要好抗体还得过亲和柱才行，做亲和柱需要的纯蛋白量太大了，一般就没必要了
包涵体纯度做多抗足够了，以前洗过一个包涵体，跑胶一丝杂带都没有，超纯....

哈，又长知识啦