我没做过,但网上有些资料:
1、“国际标准刊号:ISSN 1002-5464国内统一刊号:CN 11-2396
脂肪组织RNA提取方法的改进
吴江维 杨公社 孙超
西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,杨凌712100”
2、“提取RNA总是未果!
大家好!我是刚刚找到丁香园这个好地方的!
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我现在做的是动物脑组织RNA提取。做了三次,经RT-PCR后都没有产物。大脑组织脂肪含量相对较高。为什么脂肪含量高提取RNA就不容易成功呢?
我用的是TRIZOL 冻存3年的猪的大脑组织(时间很长了)。步骤如下(上海孤儿曾经写在这里的抽提步骤):
1. 取黄豆大小组织块在液氮中研成粉末后,用 1.5ml 离心管刮取约 50mg (绝对不要称量,太慢),移入已经加入了 1ml Trizol 的离心管中,用手用力混匀 2-3min。12000 g 离心 5 分钟,将上清倒入另外一个离心管中
2. 加入 200ul 氯仿,用手用力晃动 30s;静置 5 分钟;再晃动混匀一次,静置 5 分钟。12000 g 4 C
离心 15min
。
3. 用 100ul/200ul 移液器小心移取上清到另外一个新的 1.5ml 离心管中,加入等体积的异丙醇。上下轻摇数次混匀后,
12000g 离心 10min
。
4. 倾去上清,再短暂离心,吸弃剩余液体。沉淀中加入 1ml 75% 乙醇,使沉淀悬浮起来。静置 2 分钟后,室温 7500 g 离心 5 - 10min。再短暂离心,吸弃剩余液体。可以同样再洗涤一遍。
5. 打开离心管盖,在空气中放置 3-5min 后,加入适量 DEPC 水溶解 RNA。
只是了离心时间比原著有所改动,延长。
电泳结果见下图,是变性电泳。
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第一条是心脏组织提取的电泳结果,第二条是脑组织的。
我想刚刚抽提的RNA降解这么快是不是组织样保存太久,反复从冰箱里冻融,已经造成降解了。还是我的操作有问题呢?请达人指教。不胜感激!
图片怎么也传不上来。
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在液氮中研成粉末后,不要刮到EP管里,直接在粉末中加入Trizol,这时Trizol会冻住,将冻住的Trizol继续研磨成粉末,等Trizol重新融化为液体后,用枪吸到EP管中。
PS:你的组织是冻在-80冰箱?还是液氮?
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谢谢宜修。你的建议真的是太好了。每次研磨之后刮到EP管都会损失很多,而且担心没有充分研磨。下周我做的时候用你教的方法试一试。
我的组织样保存在-80冰箱里的。我担心总是提不出来可能是反复冻融使得组织RNA已经降解了。正在想办法找新鲜的组织样。
我也被告知脑组织的RNA不容易抽提 ,不知道为什么。只是提了有4次都未果。
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放在冰箱里可能RNA不好了,不过做RT-PCR应该没问题。
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放在冰箱里的RNA浓度也降解。我后来在RT的时候都是加大量的!
放在冰箱里的组织样了提不出RNA了。
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动物脑组织属于脂肪组织!脂肪组织RNA降解的原因很多,可能是提取过程中有污染,也可能是组织里的RNA已经有一定程度的降解,如果没有采取RNA稳定措施,建议尽量用新鲜组织;产率太低也有可能是裂解不够充分,提取前能够先研磨,再用裂解液裂解,RNA提取效果会很好。
推荐使用QIAGEN公司的RNeasy Lipid Tissue Kits(货号74804),优点是它是专门针对脂肪组织设计的试剂盒,具有组织优化的裂解液QIAzol Lysis Reagent。没有苯酚污染,产量高,非常适用于下游操作,特别是REAL TIME RT-PCR.
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50mg的脑组织样太少了,脑组织的mRNA丰度不高。
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谢谢大家的指导!
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您操作中有两处,我感觉有些不妥:
1:用手用力混匀
RNA比较脆弱,过分用力会使其断裂的。震荡应该是均匀用力、幅度较大而用力不要太大,总之目的是使提取试剂与组织充分混合。
2:沉淀中加入 1ml 75% 乙醇,使沉淀悬浮起来。
洗涤时不需要将沉淀悬浮起来。加入后在EP管内四壁过一遍,即可离心。”