包涵体： <br />包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 <br /><br />包涵体的组成与特性： <br />一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 <br /><br />包涵体的形成： <br />主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 <br />1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 <br />2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 <br />3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 <br />4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 <br /><br />包涵体表达的有利因素： <br />1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 <br />2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 <br />3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 <br />4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。 <br /><br />破菌： <br />1、机械破碎 <br />2、超声破碎 <br />3、化学方法破碎 <br /><br />分离： <br />1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 <br />2、过滤或萃取方法： <br /><br />洗涤： <br />由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 <br /><br />溶解： <br />常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。 <br /><br />去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。 <br /><br />极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH&gt;9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 <br />变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。 <br /><br />还原剂： <br />由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。 <br /><br />复性： <br />通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。 <br /><br />复性中常采用的方法有： <br />稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。 <br />透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。 <br />超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。 <br />柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。 <br /><br />还原剂的去除： <br />还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。 <br /><br />常用的氧化方法有： <br />空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。 <br />氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。 <br /><br />复性的效率： <br />复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。 <br /><br />复性过程的添加剂： <br />1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。 <br />2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。 <br />3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。 <br />4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。 <br />5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。 <br />6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。 <br />7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。 <br />8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。 <br /><br />当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。 <br /><br />复性时的蛋白浓度： <br />一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。 <br /><br />复性效果的检测： <br />根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 <br />1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 <br />2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。 <br />3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。 <br />4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 <br />5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。 <br />6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 <br /><br />几个复性的实例： <br />1、MHCII JBC 269（47）：1994 <br />增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr. <br />复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein. <br />2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5. <br />复性：10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。 <br />3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。 <br />增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml. <br />复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。 <br /><br />纯化： <br />一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond&lt;5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。 <br />当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。 <br />从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。 <br /><br />此帖转自丁香园

[[i] 本帖最后由 nano 于 08-1-18 21:16 编辑 [/i]]

其实包涵体的复性是一个很复杂的东西，虽然有一定的规律，但多数情况都是每一个蛋白都有自己特定的复性条件，每表达一个蛋白都要求进行摸索。

建议楼主把作者也列出来，以示尊重和感谢，同时也感谢楼主的分享。

包涵体一般可溶性不好，活性也不好，有没有一些避免形成包涵体的方法啊？

一般疏水结构的蛋白和表达速度较快，表达量也较大的蛋白很容易形成包涵体，要避免可以通过降低表达速度来进行，例如进行低温诱导或者降低诱导剂的加量等方法来避免。

多谢斑竹的解释！

包涵体一般可溶性不好，活性也不好，有没有一些避免形成包涵体的方法啊？
宿主与载体的选择
2.1 宿主的选择
2.1.1 选择有利于外源蛋白可溶性表达的宿主外源蛋白在大肠杆菌细胞质或细胞周质中表达时，容易被宿主本身表达的蛋白酶降解. 因此，选择蛋白酶缺失的宿主非常有利于外源蛋白的表达，尤其是外源可溶蛋白和分泌表达的蛋白. Ignatova 等[1]采用不同的大肠杆菌宿主表达青霉素酰化酶，优化培养基后，发现蛋白酶缺失的宿主BL21(DE3)表达该活性可溶蛋白优势明显. Schein 等[2]发现缺失lon 蛋白酶的大肠杆菌宿主能显著地提高RNases 的可溶分泌表达水平. 除此之外，由于大肠杆菌细胞质环境是还原性的，不利于形成二硫键，因此，如果能构建促进二硫键形成的宿主，也将有可能极大地提高可溶蛋白的表达水平[3].
2.1.2 外源蛋白与其他辅助蛋白共表达
在强启动子调控下，外源蛋白在大肠杆菌中的表达水平往往比较高，而宿主自身的折叠辅助蛋白(分子伴侣与折叠酶)显然无法满足新生肽段正确折叠的要求.因此，共表达分子伴侣和折叠酶就有可能为外源新生肽段提供充分的辅助折叠支持，进而增加可溶活性蛋白的表达量. 目前用于共表达以增加外源蛋白可溶性的辅助蛋白有GroEL/ES 和DnaK−DnaJ–GrpE、引发因子(Trigger factor)、硫氧还蛋白(Thioredoxin) 和折叠酶
(Foldase)等. 需要注意的是，应根据外源蛋白的特点有选择性地共表达分子伴侣和折叠酶. 例如在大肠杆菌中
共表达热激蛋白GroEL/ES能增加某些蛋白(α−1,6−岩藻糖基转移酶[4]、浸麻芽孢杆菌环式糊精葡聚糖转移酶[5]、谷氨酸消旋酶[6]、过氧化物歧化酶[7]、酪氨酸激酶[8]、人胶原酶原[9])的可溶性，却对其他一些蛋白(人I 型干扰素受体2c 亚基的胞外段[10]、噬菌体P22 结构蛋白[11]、人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白[12])无增溶效果. 又如GroEL/ES 与人酪氨酸激酶Lck 共表达并不能增加后者的可溶性，而硫氧还蛋白却能显著地促进该外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达[13]. 除此之外，温度也可能会对共表达折叠辅助蛋白的效果产生重要的影响. 例如preS2−S′−β−半乳糖苷酶与DnaK 和DnaJ 分子伴侣共表达，能在30∼42℃范围内提高可溶蛋白的表达水平，而共表达GroEL 和GroES 分子伴侣却只能在30℃条件下取得比较好的效果[14]. 值得一提的是，如果将几种折叠辅助蛋白分子同时共表达，有可能获得比单独表达某种折叠辅助蛋白更好的效果. Jiro 等[15]将GroEl/ES, Trx 或DsbBD 与谷氨酸消旋酶同时共表达，活性谷氨酸消旋酶的产量上升了2.2∼2.3 倍. 在某些情况下，共表达那些能增加蛋白可溶性和促进大肠杆菌生长的蛋白也能起到良好的效果. 例如Kallio 等[16]在大肠杆菌中共表达透明颤菌血红蛋白，发现该蛋白对活性蛋白的表达有明显促进作用.
2.2 载体的选择
2.2.1 启动子的选择
目前有许多启动子应用于外源蛋白的表达. 选择启动子可溶性表达外源蛋白，需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性以及经济因素等各方面加以考虑. 如果外源蛋白分泌表达，蛋白表达速率必须加以优化，以防
止大肠杆菌的转运系统达到饱和状态[17]. 因此，需要选择的启动子的强度应尽量与宿主细胞的转运能力保持
一致. 如果所表达的外源蛋白对细胞的生长有毒害作用，应尽量选择高度可抑制性和诱导性启动子，以减少
对宿主细胞的不利影响. 另外，还需要从经济和启动子诱导的操作性角度选择合适的启动子. 目前应用相当广
泛的PET 系统，调控紧密，能使克隆到T7 启动子下游的外源目的基因在IPTG(或乳糖)诱导下大量表达. 但外
源蛋白的过量表达往往形成包涵体，高水平的mRNA也容易导致核糖体的破坏和细胞死亡，而且T7RNA 聚
合酶可能导致质粒和外源基因表达的不稳定[18]. 专门用于外源蛋白低温诱导的温度敏感型启动子冷激蛋白
CspA 能在适当低温条件下达到较高的可溶蛋白表达水平[19]. Csp 启动子比较适用于那些易形成包涵体或不稳
定基因产物的外源蛋白的表达. 除此之外，阿拉伯糖启动子、pH 启动子、渗透压启动子、溶氧启动子等也日
益为人们所重视，并且有的已经成功应用于大规模生产
过程[18].
2.2.2 构建融合蛋白
通过增加连接体(Linker)而改变蛋白序列有可能改善蛋白折叠、提高蛋白的溶解性、增强抗蛋白酶降解性、
增加蛋白产量以及在培养基中分泌表达. 而对于那些外源小分子量蛋白或某些分子量较大蛋白的片段，只能考
虑构建融合蛋白才能顺利表达. 大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)与目的蛋白融合表达，除了易于分离和提高目
的蛋白稳定性外，还常具有在细胞周质分泌表达的优点.Clement 等[20]将重组单链抗体(scFvs)的C 末端与MBP融合后在细胞质内表达，发现融合蛋白的可溶性和稳定性均比未融合蛋白有了显著的提高. Spangfort 等[21]将HIV 人T 淋巴细胞受体CD4 与麦芽糖结合蛋白融合表达(LB 培养基，30℃)，发现融合表达产物可溶，并被转运到细胞周质. 多聚组氨酸(Polyhistidine)与外源蛋白融合后能通过固定离子亲合层析给外源蛋白的分离纯化带来极大便利，但组氨酸的数目与融合部位对融合蛋白的表达水平及其溶解性有显著影响[22]. 硫氧还蛋白
(Thioredoxin)与许多外源蛋白融合后能促进外源蛋白的可溶性表达，这种效应在较低温度下尤为显著[23]. 其他可供选择的融合蛋白还有钙调蛋白结合蛋白Calmodulin-binding peptide)、DsbA 和谷胱甘肽−S−转移
酶(GST)及天然大肠杆菌蛋白NusA, GrpE, BFR 等[24,25].需要注意的是，温度可能对融合蛋白可溶性表达的效果有重大影响[26]. 另外，以融合蛋白方式表达外源蛋白有三点需要慎重考虑：首先，融合表达会增加一个切除融合片断的程序，该程序往往需要昂贵的高特异性的因子，相应地增加了成本；其次，即使是较高特异性的因
子也往往会对目的蛋白发生作用，造成目的蛋白损失和杂蛋白增多；最后，即使融合蛋白表达的水平较高，经
过各种分离程序之后，目的蛋白的量可能非常有限.
2.2.3 分泌表达
由于大肠杆菌的细胞质是一个还原性环境，外源蛋白在细胞质内往往难以正确折叠. 分泌表达外源蛋白能
简化蛋白纯化工艺，除此之外，由于分泌表达后信号序列的切除，外源蛋白前端的甲硫氨酸残基不复存在，保
证了外源蛋白N−端的纯正性. 然而外源蛋白分泌表达是一个非常复杂的过程，常常会遇到诸如不完全的跨内
膜转运[18]、转运装置的容量不足[17,27]以及蛋白降解等问题[28]. 许多因素，包括外源蛋白的大小[29,30]、氨基酸组成[31]及导肽的类型[32]都会对蛋白的转运造成影响. 为获得外源蛋白的高效分泌表达，应尽量优化翻译水平，使其与大肠杆菌的转运装置的容量保持一致. 共分泌表达分子伴侣或向培养基中加入低分子量的添加剂，往往会提高外源蛋白在细胞周质内分泌表达的水平[33−35].
2.2.4 密码子的使用
密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响. 研究人员已经对蛋白表达过程中稀有密码子替换的
效应进行了深入的研究，但并没有获得一致性的结论.稀有密码子存在对某些蛋白质的表达具有负面影响[36]，
这种负面效应可能缘于某些tRNA 相对不足，或者是密码子−反密码子配对的能量差异. 在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译. 虽然在某些情况下，密码子的优化可以获得更高水平的蛋白表达，但研究人员发现，基因的表达水平并非总是受稀有密码子的限制[37]，而且tRNA 的丰度也未必与密码
子的使用相关联[38]. 值得注意的是，在某些基因中使用稀有密码子能显著降低肽链的延伸速率，从而有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达[39]. 然而，对于特定外源蛋白的表达，一个密码子优化的程序
可能是有益的，因为经过优化的基因序列往往能提高mRNA 二级结构的稳定性.

培养条件与诱导方法的选择 3.1 降低培养温度 最适合大肠杆菌生长的温度在37∼39℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体. 低温培养条件下 表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例. 表1 表明不同外源蛋白在大肠杆菌中低温表达时，可溶蛋白表达 水平将明显提高. 由表可见，降低培养温度能增加不同来源的外源蛋白可溶性. 但培养温度也有一个下限，一 般为8∼10℃，因为在此温度以下，大肠杆菌将停止生长，蛋白也基本上停止表达. 定点突变可能会对表达可 溶蛋白的温度选择有重要影响. Mainfroid 等[47]发现人丙糖磷酸异构酶37℃下能在大肠杆菌中可溶表达，而丙糖磷酸异构酶的两个突变体Met14Gln 和Arg98Gln 却在7℃下形成没有活性的包涵体，在28℃下才获得可溶 表达. 在某些情况下，不同的培养温度都能表达可溶性蛋白，但是降低培养温度具有3 个优势：首先，低温下 培养基中的氧气溶解性更高，高密度培养时，能有效防止菌体厌氧生长，防止对菌体生长和外源蛋白表达有抑 制作用的乙酸的生成；其次，低温培养时，抗生素的半衰期更长，质粒稳定性也可能会相应增加；最后，降低 培养温度能降低可溶蛋白降解速率，提高可溶蛋白的稳定性. 降低培养温度能提高外源蛋白可溶性的原因目前还没有满意的解释. 不少研究人员认为，低温能降低蛋 白质合成的速率，改变多肽折叠的动力学，从而导致正确折叠的蛋白增加[48]. 但是，蛋白表达速率与蛋白可溶 性之间并不存在必然的联系. Schein 等[42]通过改变SD序列与起始密码子ATG 之间的距离来改变Mx 蛋白合 成的速率，发现该蛋白在37℃都会形成包涵体，而底物不足导致蛋白合成速率下降时，并不能获得外源蛋白 可溶性表达量的增加[49]. 低温培养更有利于可溶性蛋白表达的另一个原因可能是外源蛋白在低温下表达时， 蛋白区室化效率更高[2]，也可能在较低温度下，与蛋白折叠和蛋白聚合相关的蛋白的表达更有利于菌体形成 稳定的可溶性蛋白[50]. 3.2 培养基的组成 培养基的组成对可溶外源蛋白的表达有显著影响.由于复合培养基成分复杂，在发酵过程中很难准确分析 哪些成分对菌体细胞生长和蛋白表达有重要影响，所以一般推荐使用合成培养基. 但合成培养基往往又存在菌 体生长较慢和菌体浓度较低的问题，因此研究人员为此做了许多卓有成效的工作[51]. 一般来讲，在表达外源蛋 白时，要尽量避免由于营养物质缺乏导致的菌体生长抑制的情况发生. 外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的 影响，虽然葡萄糖比较适合作为菌体生长的碳源，但在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖. 以甘油代 替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一[52]. 在诱导时期，流加营养物质也有可 能显著提高可溶蛋白的表达量[53,54]. 在某些情况下，向培养基中添加蛋白抑制剂也能提高可溶蛋白量. Palva 等[55]在培养基中添加蛋白酶抑制 剂，对生产来自枯草杆菌的干扰素非常有效. Slabaugh等[56]将核苷酸还原酶抑制剂羟基脲添加到培养基中，发现核苷酸还原酶亚基vvR1 量明显上升. 如果外源蛋白在细胞周质表达，向培养基中添加适当浓度的某些非代 谢性糖类(比如蔗糖)也可能有利于可溶蛋白的表达. 当外源蛋白在细胞质表达时，非代谢性糖类由于细胞膜的 阻碍不能扩散到细胞质中，但这些糖类的存在会增加培养基的渗透压，进而导致细胞质内渗透压防护剂(比如 甘氨酰−三甲铵乙内酯)的积累，这种渗透压保护剂与周质中的非代谢性糖类一样，能抑制细胞质中外源蛋白的 聚合，从而提高可溶蛋白的表达水平[57]. 外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适 量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，因此也有可能增加可溶蛋白的表达量[43]. 某些外源蛋白的活性和 稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提高蛋白的可溶性和稳 定性[58].另外，良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2 和乙酸的浓度，也有可能获得高产量的活性蛋白[59]. 在蛋白表达过程中，培养基的pH值也会对可溶蛋白的表达产生重要影响，需要根据菌体和目的蛋白的特点选择合适的pH 值. 3.3 诱导条件 在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白时，诱导时机和诱导剂的用量必须严格控制. 在摇瓶培养时，普遍认为 在低菌体浓度下诱导比较合适，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白. 然 而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达. 工业上 往往采用高菌浓度补料诱导制备大量可溶蛋白，比如纤维原细胞生长因子⎯皂角苷融合蛋白的生产就是采用 补料方法达到A600=85 的高菌浓度后，在30℃下用IPTG诱导表达，分离纯化后1 A600 单位可溶性丝毒素达到了2.2 mg/L[60]. 也可考虑在高菌浓度下低温诱导采用冷激启动子高效表达可溶性蛋白. 诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择[48,52].在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平[46]. Saraswat 等[61]以乳糖流加诱导的方式表达重组人白细胞介素−2，发现乳糖流加诱导的可溶重组人白细胞介素−2 的表达水平(9.3 g/L)显著高于一次性乳糖流加诱导的表达水平(5.4 g/L). 4 通过改变蛋白结构增加可溶性 自从包涵体被发现以来，其形成原因一直是研究人员探讨的焦点，实现外源蛋白的可溶性表达也依赖于对 该问题的解答. 降低培养温度并不能促进所有外源蛋白的可溶性表达，人们也无法解释42℃时某些外源蛋白 完全可溶的情况，而对这些蛋白进行定点突变却能在所有温度下获得可溶性表达. 值得注意的是，虽然定点突 变可能增加外源蛋白的可溶性，但不能简单地将这种效应归因于蛋白疏水性和某些特定氨基酸含量的改变. 这 种可溶蛋白的增加也可能是突变后外源蛋白对蛋白降解的稳定性的增加或者与分子伴侣相互作用增强的次 级效应所致[62]. Murby 等[63]在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒主要糖蛋白的101 个氨基酸片段时，将该片断的若干个苯丙氨酸残基进行了突变，发现病毒糖蛋白片段的溶解性和对蛋白酶的稳定性有了显著的提高，而且突变后的蛋白片段与原蛋白片段具有相同的抗原性和二级结构. 定点突变还可能改变温度对蛋白可溶性的效 应. 需要引起注意的是，虽然可以通过突变导致蛋白降解的位点来提高外源蛋白对蛋白酶的稳定性，但是这种 突变可能会对蛋白活性造成极大影响[64]. 目前，研究人员已经开始根据已知蛋白的结构和活性特征，利用计算 机有针对性地对蛋白突变进行设计，大大地提高了获得 具有高活性和高稳定性蛋白的效率和可能性[65,66]. 外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略 朱红裕, 李 强(清华大学化学工程系生物化工研究所，北京 100084)

                        包涵体表达的蛋白的复性

 

摘要  综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。

 

关键词  包涵体  蛋白质  复性

 

Abstract  Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.

 

Key words  inclusion body , protein , renaturation

 

外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。

 

一、包涵体：

 

1.1包涵体的定义、组成与特性：

 

包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。   一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1]

 

1.2包涵体的形成：

 

主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

 

1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

 

1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

 

1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

 

1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

 

1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2]

 

1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。

 

1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解

 

1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以5000-20000g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。

 

1.3.2洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。[3]

 

1.3.3溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula  Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas  mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。[4]

 

二、复性：

 

   由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。