双酶切连接反应之全攻略（原创）--springwel《丁香园》
本帖被 frankyuchina 设置为精华(2007-09-18)
双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：
http://img.dxy.cn/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为
0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
3、转化：
a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。也可离心后余100μl
几个非常重要的问题
1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.
2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干
3对照的设立：
为验证双酶切是否成功,可做如下对照:
A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时,也要进行对照.
设4个:
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒
C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.
4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。
希望大家不断补充。
JM108感受态细胞的制备
刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了10支。后来干脆自己做，感觉质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。
前期工作
分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓‘磨刀不误砍材功’。
注意事项
1.不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种划板（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划S行。同时记得设立对照：A 、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道，实验室很多材料从师姐传师妹，或许经过很多人的转手。所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP阴性空白培基。系统控制参照，为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑克隆。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体系25微升）会全量加到200微升的感受态里，约为150ng（载体0.1微克，目的片段约0.05微克）。效果也好。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。国产的当然也可以。我用都是国产的，好像是陇西化学制剂，分析纯。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
培养基的配制
1.配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基：精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g， 氯化钠l0g，加去离子水800ml充分搅拌溶解，用1mol/LNaOH调pH7.0，补加去离子水至1000毫升，高压灭菌，4度保存。我一般没有用1mol/LNaOH调pH7.0。而是直接精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g， 氯化钠l0g加去离子水至1000ml。
2.LB固体培养基：LB液体培养基中加1.5%琼脂粉,高压灭菌消毒；
3.Amp母液：用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml即100 ug/ul溶液,置-20℃保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得。然后分5支分装(浓度100mg/ml即100 ug/ul)。
4.含Amp的LB固体培养基：将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板（30ml/90mm）：即多少毫升培养基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减半量则最终浓度为50ug/ml
有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基。我从来只用AMP阴性的普通培基，效果也很好。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:我们实验室只有CaCl2-6H2O，分子量219，配制100ml的，则需称量0.005×219=1.095g就可以了。其实氯化钙的摩尔浓度在0.05-0.1mol/L均可。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 先配制成0.1mol/L的氯化钙溶液50ml，加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。有文献说要用0.22的滤器，其实完全没有必要。高压即可。
准备工作做好了，就可以开工了。
一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的JM109单菌落,接种于3-10ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右（一般过夜）。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于10ml试管（如较多制备，多用几个试管即可）的LB液体（AMP阴性）培养基中同时做空的培基对照,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液分转入1.5ml的离心管中（一管10ml菌液可分装成约6管1.5ml的离心管中）,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液200微升轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入200微升预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、贮存于-70℃可保存半年。
要点：1.悬浮细胞时动作一定要轻柔；2 冰上。掌握者两点可谓掌握了制备感受态的精髓，无往不利。
源于FRANK, 谢谢
