酵母表达系统
[align=center][b]酵母表达系统[/b][/align][b][font=宋体][size=3]主要内容[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]:[/font][/size]#Kx TJ t ff+c,U
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[color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]7. [/font][/size][font=宋体][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8290&page=1#pid32130]甲醇酵母表达影响因素[/url][/size][/font][size=11pt][/size] a,C)AkJ:Hy n'u
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[font=宋体][/font]
[font=宋体][size=11pt]主要参考资料：[/size][/font][size=11pt][/size]
[font=宋体][size=11pt]酵母表达系统及其应用研究 《生命的化学》[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]2003[/font][/size][font=宋体][size=11pt]年[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]23[/font][/size][font=宋体][size=11pt]卷[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]1[/font][/size][font=宋体][size=11pt]期[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]吴丽娟[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]蒋建新[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size]k7xR/Z2Z3z E
[font=宋体][size=11pt]毕赤酵母表达外源基因研究进展[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] 《[/font][/size][font=宋体][size=11pt]微生物学免疫学进展》[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]2004[/font][/size][font=宋体][size=11pt]年第[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]32[/font][/size][font=宋体][size=11pt]卷第[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]1[/font][/size][font=宋体][size=11pt]期[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]王勇[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]刘哲伟[/size][/font]
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酵母表达系统
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甲醇酵母细胞表达系统
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甲醇酵母表达实验步骤
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甲醇酵母感受态细胞制备及转化
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甲醇酵母表达载体及其元件
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甲醇酵母表达注意事项
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甲醇酵母表达影响因素
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甲醇酵母表达常见问题及解析
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甲醇酵母表达系统的应用及前景
[align=center][b]甲醇酵母表达系统的应用及前景[/b][/align]
[align=left][b]1．在病原生物学领域中的应用[/b] !M fV` |*r8c1^ t ?&G
甲醇酵母表达系统经过20多年的发展，已成为较完善的外源基因表达系统。应用该系统已高效分泌表达了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白、蛋白酶抑制剂、膜蛋白等。。。在国内，甲醇营养型酵母表达系统主要应用在病 原生物学领域，如：SMAD4 (肿瘤抑制基因)蛋白、痘苗病毒生长因子(VGF)戊型肝炎病毒结 构区ORF2蛋白、旋毛虫肌幼虫Es抗原特异性蛋白的2个结构基因及恶性疟原虫裂殖子表 面蛋白1(MSP1) 等的表达研究。 *E u7^[ HB
（1）痘苗病毒生长因子 M'T Oq g HpR+g
痘苗病毒生长因子是痘苗病毒编码的一种小分子细胞因子样物质，其成熟肽段可以促进上皮 细胞的增殖。由于VGF具有十分广阔的应用前景，因此建立一种可以适用于大规模生产 VGF的表达系统，实现VGF的高效表达对于开发新型药物，特别是治疗创伤类药物具有十分重大的意义。吉林大学生命科学院分子生物学系的研究人员已经成功地利用毕赤酵母表达系统表达了具有生物活性的可溶性痘苗病毒生长因子，这对开发新药物以及在治疗创伤等 方面的应用开辟了广阔的前景。 6w%M-s.@}&L&f
（2）寄生虫领域中的应用 c E/pp+q
寄生虫是一类对人类和动物危害极其严重的病原体。分子寄生虫学主要在分子水平上研究寄 生虫的发生、发展、免疫、诊断、基因结构与功能关系、疫苗和药物机制等。 IB f d:n `
甲醇酵母表达系统已经被成功地应用到寄生虫领域的研究工作中。河南省农科院畜牧研究所曾利用毕赤酵母表达系统成功地使旋毛虫肌幼虫ES抗原特异性蛋白的2个结构基因分泌 表达。他们的研究表明，在大肠杆菌和酵母菌中表达的重组蛋白都是研制旋毛虫基因组抗原 的良好候选抗原蛋白，尤其是酵母菌表达的糖蛋白，在旋毛虫病的检测和免疫方面具有潜在 的开发应用价值。另外，已经有科学研究人员将毕赤酵母表达系统成功地应用到了疟原虫疫 苗和血吸虫疫苗(Sm28GST)的研究中。研究人员利用Sm28GST重组蛋白免疫大鼠、小鼠和狒狒均能在动物体内诱导出保护性免疫反应，现正在进一步试验中。第二军医大学病原生物 学教研室已经成功地使MSP1在毕赤酵母中表达。MSP1是当今疟疾疫苗主要的候选抗原。研究证实表达产物能与识别MSP1分子二硫键依赖构象表位的特异性单抗发生很强的反 应，表明MSP1重组蛋白至少在该表位构象上与天然蛋白一致，从毕赤酵母中分离得到大量 MSP1为开展该蛋白的结构与功能，特别是测定其疟疾保护性免疫提供可能。
[b]2．酵母表达体系在抗体工程中的应用[/b]
到目前为止，许多完整的抗体、抗体片段如Fab，单链抗体等均已在酵母中成功表达。在E.coli中以不溶性的包涵体形式聚集的蛋白质，在酵母中表达时常常是可溶的，而且异源蛋 白的降解问题也可部分得到解决。同时，在酵母表达系统中，分泌的重组抗体片段可以得到高水平表达。抗CD7和抗DMI的2 种抗体，在E.coli中的表达水平是0.25mg／L，但是在 甲醇营养型酵母中的产量则分别为 60mg／L和10~25mg／L。同样，有功能的兔抗重组白血病抑制性scFv在甲醇营养型酵母中的产量比在E.col中高100倍以上。在抗体工程中，酵母表达体系越来越受到重视。在大肠杆菌中不表达或表达水平很低，或 者以包含体形式聚集，亦或需要糖基化修饰的抗体或其片段，均可以考虑使用酵母表达体系，以高效表达有活性的抗体分子。;e7hjZ0F v
甲醇酵母表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力等自身优势，使之越来越受到关注，其研究和商业价值亦不断体现。在载体构建和新型菌株的开发方面，已经取得卓有成效的研究成果，例如Invitrogen公司不断开发的新产品使此表达体系的前期研究愈加完善，其开发出的快速筛选表达试剂盒(包括质粒pPICZ和pPICZa及其它必需材料)、多拷贝表达试剂盒(包括质粒pPIC3．5k，pPIC9k及 pAO815及其它必需材料)以及经典表达试剂盒(包括质粒pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2及 pHIL．S1及其它必需材料)大大方便了科研工作者的实验工作。而对后期发酵过程和培养基配方等尚有待于进一步开展开创性的探索研究，突破传统培养发酵模式，优化培养基配方，为提高外源蛋白的表达量作出有益的探索。g(h)E L4m ]*F
[b]3．缺陷及对策
[/b] 尽管甲醇营养型酵母表达系统被认为是极具发展前景的真核表达系统，许多表达产物已用于临床治疗及预防，如：类胰岛素生长因子(IGF)、乙肝疫苗、人血清白蛋白，但它并不是万能的表达系统，作为一种新的表达系统，和其它表达系统一样，巴氏系统也并非尽如人意，同样有其局限性，仍然存在这样或那样的缺陷或不足。如分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在，发酵周期较长，易污染，且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达；利用易燃的甲醇做原料，表达产物的卫生安全性需要考虑；筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限；低表达或不表达的例子也在增多。信号肽加工不完全，修饰功能欠完善以及内部降解等现象，给外源蛋白的纯化和工业化带来了困难。[/align][align=left] 而且，与安全可靠、背景清楚的酿酒酵母相比，巴氏系统还有其它缺点：[/align][align=left] (1)分子生物学的研究基础差，要对其进行遗传学改造困难较大。[/align][align=left] (2)不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇， 所以，要用它来生产药品或食品还没有被广泛接受。[/align][align=left] (3)发酵虽然能达到很高的密度，但是发酵周期一般较长。?O9c TW}
其中最重要的一个缺陷就是分泌表达的蛋白在培养基中被自身分泌的蛋白酶降解，由于甲醇酵母多采用高密度发酵，蛋白酶也会随着细胞密度的增高而增高。
下面三种方法可以在发酵过程中有效降低外源蛋白的降解：①添加富含氨基酸的添加剂，如：胰蛋白胨，它们可以作为蛋白酶的底物被分解而减少目的蛋白的降解；②改变培养基 pH值，由于毕赤酵母可以在pH值为3.0～7.0的范围内正常生长，调节 pH值可以改变蛋白酶的活性，从而减少蛋白质的降解；③应用蛋白酶缺陷型菌株，如：SMD1163、1165、1168。
其次，有些蛋白在毕赤酵母中表达量很低或不表达，原因至今尚未完全阐明，但可能与以下几方面有关：[/align][align=left] ①毕赤酵母与人及其它物种一样对所使用的氨基酸密码子具有不同的偏好性，这可能限制其蛋白质翻译速度。比较 110种酵母基因密码子使用情况发现，所有基因可分为明显的两组：高表达组和低表达组。高表达组基因的密码子相应的tRNA也明显高于低表达组，第三位密码子为胞嘧啶的比例也明显升高，AT含量则比较低。鉴定酵母和人类使用频率最低的密码子发现：8个低频密码子中有6个是一样的，无论大肠杆菌，果蝇，还是酵母和人类，大量表达的蛋白基因中低频密码子则明显减少，低频密码子含量高的蛋白质大量表达都是对其自身有害的。为了在毕赤酵母中表达HIV-2外壳糖蛋白gpl05，Zhang YJ等将低频密码子AGG突变为同源的CGA，编码天冬氨酸的GAT突变为编码谷氨酸的 GAA，并引入了酵母偏好的TCC，最终实现了gpl05在其中的高表达；[/align][align=left] ②当整合拷贝数增多后，可能在转录水平产生后生(Epigenetic)的调节，影响重组蛋白产率的提高；[/align][align=left] ③转录提前终止，这主要是因为AT含量过多引起的。据报道HIV．1 gpl20就是因为在AT丰富区因转录提前终止而不能在毕赤酵母中表达，在酿酒酵母中有一些共有序列，类似于HIV-1gpl20中引起转录提前终止的AT丰富区域，如：TTTTATA，当改变这些序列后，就可发现更长的mRNA出现。 (D;H/VA C A.`
尽管存在不足之处，巴氏系统还是非常适合于基因工程产品的研制和开发。相信随着菌株及载体等方面的进一步完善，表达条件的充分优化，巴斯德毕赤酵母表达系统将不负众望，展现更美好的未来。[/align]
甲醇酵母表达系统常用试剂及培养基
**** Hidden Message *****[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:58 编辑 [/i]]
甲醇酵母常用密码子
**** Hidden Message ***** TutZ:n8gs^cBE7Dd
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:58 编辑 [/i]] 非常感谢楼主提供的资源!#QNRLnR'k
代所有分子生物学者、微生物学者、生化学者向您致敬！
求教
请问酿酒酵母用LiCl、PEG转化的时候质粒是不是不能线性化，而进行电转化的时候必须将质粒线性化。非常感谢！！我的邮箱是[email]yezi354@163.com[/email] [quote]原帖由 [i]csy2008[/i] 于 07-12-7 10:58 发表 [url=http://bbs.genecool.com/redirect.php?goto=findpost&pid=45520&ptid=8290][img]http://bbs.genecool.com/images/common/back.gif[/img][/url]请问酿酒酵母用LiCl、PEG转化的时候质粒是不是不能线性化，而进行电转化的时候必须将质粒线性化。非常感谢！！我的邮箱是[email=yezi354@163.com]yezi354@163.com[/email] [/quote]
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