快速诊断技术
[size=3][color=#000000][align=center][font=宋体][size=11pt][b]快速诊断技术[/b][/size][/font][size=11pt][/size][/align])T,D H v{I[font=宋体][size=11pt]主要内容：[/size][/font][size=11pt][/size]
[color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]1[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31737]免疫胶体金基本原理[/url][/size][/font][size=11pt][/size] S q-h T)i)a/s"U
[size=11pt][font=Times New Roman]2[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31738]胶体金制备方法及标记技术分类[/url][/size][/font][size=11pt][/size]
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[size=11pt][font=Times New Roman]5[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31741]胶体金标记技术[/url][/size][/font][size=11pt][/size]
[size=11pt][font=Times New Roman]6[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31743]制作胶体金试纸的硝酸纤维素膜选择及应用技巧[/url][/size][/font][size=11pt][/size]6@ FZEHz
[size=11pt][font=Times New Roman]7[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31744]免疫荧光技术基本原理[/url][/size][/font][size=11pt][/size]
[size=11pt][font=Times New Roman]8[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31748]免疫荧光实验方法及分类[/url][/size][/font][size=11pt][/size]eP&FMF
[size=11pt][font=Times New Roman]9[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31750]免疫荧光实验步骤[/url][/size][/font][size=11pt][/size]m6c|0qQ:kG
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[size=11pt][font=Times New Roman]13[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31754]细胞因子检测技术应用[/url][/size][/font][size=11pt][/size]5{k$I$[1\ ag
[size=11pt][font=Times New Roman]14[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[/size][/font][/color][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=1#pid31755][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]ELISPOT[/font][/size][font=宋体][size=11pt]技术原理[/size][/font][/color][/url][size=11pt][/size]'vA9u6{^?$rVzmW
[color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]15[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[/size][/font][/color][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=2#pid31757][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]ELISPOT[/font][/size][font=宋体][size=11pt]技术实验步骤[/size][/font][/color][/url][size=11pt][/size]
[color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]16[/font][/size][font=宋体][size=11pt]．[/size][/font][/color][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8205&page=2#pid31758][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]ELISPOT[/font][/size][font=宋体][size=11pt]技术优势及应用[/size][/font][/color][/url]8d8`}5ib w lc
[font=宋体][size=11pt][/size][/font]
[font=宋体][size=11pt][b]声明[/b]：[/size][/font][size=11pt]
[font=Times New Roman]1[/font][/size][font=宋体][size=11pt]、本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍，由酷友搜集、分析、整理、审改，供大家学习参考用，如有转载、传播请注明源于基因酷及本篇的工作人员；若本篇侵犯了您的版权或有任何不妥，请[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]Email [/font][email=genecool@126.com][font=Times New Roman][color=#000000]genecool@126.com[/color][/font][/email][/size][font=宋体][size=11pt]告知。[/size][/font][size=11pt],f(y8nyX&Z3k`
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[font=宋体][size=11pt][b]致谢[/b]：[/size][/font]
[font=宋体][size=11pt]整理者：[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]microfox [/font][/size][font=宋体][size=11pt]审改者：[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]wny;N8Owh!j#G(g+D-C
[/font][/size]
[font=宋体][size=11pt]主要参考资料：[/size][/font]
[font=宋体][size=11pt]《现代临床免疫学》[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]赵武述[/size][/font]
[font=宋体][size=11pt]免疫胶体金技术基本原理及其在疾病检测中的应用进展[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]李忠秋[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]马红[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]郭镇华[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]吴赛辉[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]刘娣[/size][/font]E:zz r3h-{ mi{
[font=宋体][size=11pt]免疫荧光基础实验新原理及其临床[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]德）斯托尔希（[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]Storch[/font][/size][font=宋体][size=11pt]，[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]W.B.[/font][/size][font=宋体][size=11pt]）主编，阮幼冰[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]主译[/size][/font]
[font=宋体][size=11pt]细胞因子检测技术进展[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]李梅[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]宋达琳[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]康维强[/size][/font]
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快速诊断之免疫胶体金基本原理
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快速诊断之胶体金制备方法及标记技术分类
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快速诊断之胶体金标记实验步骤
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快速诊断之胶体金制备注意事项及应用
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快速诊断之胶体金标记技术
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制作胶体金试纸的硝酸纤维素膜选择及应用技巧
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快速诊断之免疫荧光技术基本原理
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快速诊断之免疫荧光实验方法及分类
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快速诊断之免疫荧光实验步骤
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快速诊断之免疫荧光常见问题
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快速诊断之细胞因子检测原理
[align=center][b]细胞因子检测原理[/b]zpy I ?)b[/align]Vk!p3p,h-Q
目前，细胞因子已广泛应用于临床的已有EPO、IFN-α、G-CSF、GM-CSF以及试用于临床的白细胞介素等。为了研究细胞因子在生理系统的作用以及了解细胞因子产品用于临床治疗的效果，进行细胞因子的检测就必不可少，而且用于临床诊断的细胞因子分析方法必须适用于常规操作。细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采用的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床治疗带来一定的困难。因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响细胞因子浓度的因素。
细胞因子检测技术可分为分子生物学测定法，生物活性测定法和免疫化学测定法三大类。从细胞因子及其受体检测的水平来说，可以分为基因组DNA、mRNA和蛋白三个不同的水平，后者又包括胞浆内、膜表面以及分泌到体液或培养上清等三种不同形式细胞因子。目前应用最多的是检测体液或培养丰清中的细胞因子以及膜表面的细胞因子受体。
细胞因子在机体免疫应答过程中起着十分重要的作用。在某些疾病时，体内细胞因子及其受体表达可发生异常，与机体免疫功能低下或发生病理损伤有关。因此，在临床免疫学中越来越重视对细胞因子及其受体的检测。在基础免疫研究中，常需检测不同条件培养液中细胞因子的活性，并探讨细胞因子产生水平与免疫细胞表型、增殖、杀伤及其它功能的关系。此外，原核细胞和真核细胞中表达的重组细胞因子或经过不同工艺纯化后的产品需测定其活性和含量。
细胞因子的生物学活性 A\y)Q(un
细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。 v0a,x.L d$E
1） 免疫细胞的调节剂Z?0w_+I['bb
免疫细胞之间存在错综复杂的调节关系，细胞因子是传递这种调节信号必不可少的信息分子。例如在T-B细胞之间，T细胞产生IL-2、4、5、6、10、13，干扰素γ等细胞因子刺激B细胞的分化、增殖和抗体产生；而B细胞又可产生IL-12调节TH1细胞活性和TC细胞活性。在单核巨噬细胞与淋巴细胞之间，前者产生IL-1、6、8、10，干扰素α，TNF-α等细胞因子促进或抑制T、B、NK细胞功能；而淋巴细胞又产生IL-2、6、10，干扰素γ，GM-CSF，巨噬细胞移动抑制因子（MIF）等细胞因子调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节作用。例如T细胞产生的IL-2可刺激T细胞的IL-2受体表达和进一步的IL-2分泌，TH1细胞通过产生干扰素γ抑TH2细胞的细胞因子产生。而TH2细胞又通过IL-10、IL-4和IL-13抑制TH1细胞的细胞因子产生。通过研究细胞因子的免疫网络调节，可以更好地理解完整的免疫系统调节机制，并且有助于指导细胞因子做为生物应答调节剂(biologicalresponsemodifier,BRM)应用于临床治疗免疫性疾病。"Y AY"C+ZW1t
2） 免疫效应分子,ex o,~ \;~v
在免疫细胞针对抗原（特别是细胞性抗原）行使免疫效应功能时，细胞因子是其中重要效应分子之一。例如TNFα和TNFβ可直接造成肿瘤细胞的凋零(apoptosis),使瘤细胞DNA断裂,细胞萎缩死亡;干扰素α、β、γ可干扰各种病毒在细胞内的复制，从而防止病毒扩散；LIF可直接作用于某些髓性白血病细胞，使其分化为单核细胞，丧失恶性增殖特性。另有一些细胞因子通过激活效应细胞而发挥其功能，如IL-2和IL-12刺激NK细胞与TC细胞的杀肿瘤细胞活性。与抗体和补体等其它免疫效应分子相比，细胞因子的免疫效应功能，因而在抗肿瘤、抗细胞内寄生感染、移植排斥等功能中起重要作用。$^d1O%G.p)W
3） 造血细胞刺激剂
从多能造血干细胞到成熟免疫细胞的分化发育漫长道路中，几乎每一阶段都需要有细胞因子的参与。最初研究造血干细胞是从软琼脂的半固体培养基开始的，在这种培养基中，造血干细胞分化增殖产生的大量子代细胞由于不能扩散而形成细胞簇，称之为集落，而一些刺激造血干细胞的细胞因子可明显刺激这些集落的数量和大小因而命名为集落刺激因子（CSF）。根据它们刺激的造血细胞种类不同有不同的命名，如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、multi-CSF(IL-3)等。目前的研究表明，CSF和IL-3是作用于粒细胞系造血细胞，M-CSF作用于单核系造血细胞，此外Epo作用于红系造血细胞，IL-7作用于淋巴系造血细胞，IL-6、IL-11作用于巨核造血细胞等等。由此构成了细胞因子对造血系统的庞大控制网络。某种细胞因子缺陷就可能导致相应细胞的缺陷，如肾性贫血病人的发病就是肾产生Epo的缺陷所致，正因如此，应用Epo治疗这一疾病收到非常好的效果。目前多种刺激造血的细胞因子已成功地用于临床血液病，有非常好的发展前景。S9Q)P x oMmg
4） 炎症反应的促进剂 d!}X#K X$V&hn|0@
炎症是机体对外来刺激产生的一种病理反应过程，症状表现为局部的红肿热痛，病理检查可发现有大量炎症细胞如粒细胞、巨噬细胞的局部浸润和组织坏死，在这一过程中，一些细胞因子起到重要的促进作用，如IL-1、IL-6、IL-8、TNFα等可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放,可直接刺激发热中枢引起全身发烧,IL-8同时还可趋化中性粒细胞到炎症部位,加重炎症症状.在许多炎症性疾病中都可检测到上述细胞因子的水平升高.用某些细胞因子给动物注射,可直接诱导某些炎症现象,这些实验充分证明细胞因子在炎症过程中的重要作用.基于上述理论研究结果,目前已开始利用细胞因子抑制剂治疗炎症性疾病,例如利用IL-1的受体拮抗剂(IL-1receptor antagonist,IL-lra)和抗TNFα抗体治疗败血性休克、类风湿关节炎等，已收到初步疗效。
5） 其它
许多细胞因子除参与免疫系统的调节效应功能外，还参与非免疫系统的一些功能。例如IL-8具有促进新生血管形成的作用；M-CSF可降低血胆固醇IL-1刺激破骨细胞、软骨细胞的生长；IL-6促进肝细胞产生急性期蛋白等。这些作用为免疫系统与其它系统之间的相互调节提供了新的证据。
WXc({a%D r o/v
[[i] 本帖最后由 microfox 于 07-8-15 11:01 编辑 [/i]]
快速诊断之细胞因子检测方法分类
**** Hidden Message *****Ds MP+BK R[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:15 编辑 [/i]]
快速诊断之细胞因子检测技术应用
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[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:16 编辑 [/i]]
快速诊断之ELISPOT技术原理
**** Hidden Message *****[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:16 编辑 [/i]]
快速诊断之ELISPOT技术实验步骤
[align=center][b]ELISPOT技术实验步骤[/b][/align]K5Q S({?0T'w(h#R r3k
从原理上看ELISPOT的确很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。 K+J&F:f+U y
（1） 将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上，用胶带封板并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗6遍，再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭，室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。$U7D:k"A%F"||
（2） 将阴性对照和细胞样品，如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC，用含10%FCS的培养基稀释至5×104～2×105个/孔如果条件可以达到更高的细胞数，建议可以尝试3×105～5×105个/孔，特别是在分泌细胞），分装于ELISPOT板孔中，再加入特异的刺激物，如多肽或基因表达产物，提取的抗原等，阴性对照孔中只加入培养基（实验中最好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应），阳性对照孔加入植物血凝素(PHA，2μg/mL)或阳性多肽，37℃，体积比为5% CO2培养24～48h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至10-12的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍最后斑点的显色。只要细胞可以正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，最后还是可以显示出斑点。 m)|Ccde @'h%C F
（3） 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞因子的检测抗体，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP标记的链亲和素，室温孵育3h。)U0f;F+X R
（4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室温下显色，待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时，即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数，并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原，则可用于ASC测定，这时，每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。D3v#`#W| bi q
完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用photoshop进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断绝对是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使ELISPOT的应用范围更加扩宽。
（5） ELISPOT 斑点的判读像多数的Cell-based分析技术一样，ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。Wu!_#TBR4Q|F)?;y
科学实证的本质，在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性，传统的人工计算法显然无法达到此一要求。故而有几个科研团队使自行开发Plate Scanner与自动分析软件，其中以Paul Lehmann教授研究开发之ImmunoSpot? Analyzer自动分析仪最具代表性。分析ELISPOT实验数据的过程中，仪器先以高分辨率镜头捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后储存成TIF檔；这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目，如果使用ImmuneSpot分析软件，可以先设定条件，然后同时分析斑点的大小，以推估激素分泌的多寡。预料像ImmunoSpot? Analyzer这一类自动图像扫描分析仪器，将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点，彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题，进一步推广该技术的新颖应用。
ImmunoSpot@影像扫描分析仪可以提供不同的数据格式，包括未处理与处理过的膜表面影像、每个小孔中的斑点数目、每个小孔中的平均斑点数目、每个小孔中斑点大小的直方统计图。]&w~m1Dx1Kb;A:KYl
,Ta)v+J.V'P B"y*S j
ELISPOT分析仪的出现解决了以下问题 u.KEc)_j.d9{[
哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值） /`~AD4D
斑点大小的意义 。
在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸 Eq0O$W~ e
如何从单个细胞基础上分析 T!Q4E ja9D2H"~"Yf7y
实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果
几次重复实验才能使结果更有意义
%] h4mX wx fn [
[[i] 本帖最后由 microfox 于 07-8-15 11:02 编辑 [/i]]
快速诊断之ELISPOT技术优势及应用
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[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:17 编辑 [/i]] 谢谢楼主！！！！！ 谢谢楼主W D*cZ"I }I8F|5I
十分受用 十分受用，谢谢楼主！
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