基因酷 基因库 Genecool » 基础实验技术 » Western Blot(免疫印迹)

phyllis03 发表于 07-8-13 17:28

Western Blot(免疫印迹)

[align=center][b]Western Blot[/b][/align]6J1yC1uOF[:O5yz
主要内容：jaF;jM#B
[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8199&page=1#pid31696][color=blue]1.Western Blot原理[/color][/url]
Q:\7Xk0\(n [url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8199&page=1#pid31697][color=blue]2.Western Blot试剂的准备[/color][/url]"F]%v$hbSC5a
[url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8199&page=1#pid31698][color=blue]3.Western Blot 实验过程[/color][/url]
e~ WLU2vS Pir5S [url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8199&page=1#pid31699][color=blue]4.Western Blot 应用[/color][/url]
"W!^lM_ C [url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8199&page=1#pid31700][color=blue]5.Western Blot 常见问题分析[/color][/url]
q#t7t7|_o4f,b*c%p
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整理者：phyllis  审改者：nano  db
+[.xLnu"D:t!N 主要参考资料：《蛋白质技术手册》、《蛋白质电泳实验技术》W Jn({ o,Q Es
4i+](v5Dkw5f2nn
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:45 编辑 [/i]]

phyllis03 发表于 07-8-13 17:29

Western Blot原理

[align=center][b]Western Blot原理[/b][/align]5_0H(m*_8D)b3H0yh
　　Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
+])W?0d"Lt6Qy'C%^ 　　推荐书籍：《分子克隆》、《抗体技术实验指南》、Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）、《蛋白电泳实验技术》、《蛋白质技术手册》等。9o ~n?%@8r
V4H
[b]原理[/b] {WVl"iU({wz Y&l
　　与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

phyllis03 发表于 07-8-13 17:33

Western Blot试剂的准备

**** Hidden Message *****

phyllis03 发表于 07-8-13 17:35

Western Blot 实验过程

**** Hidden Message ***** y l7O"d}
J6XBoj;i0@J
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:46 编辑 [/i]]

phyllis03 发表于 07-8-13 17:37

Western Blot 应用

[align=center][b]Western Blot 应用[/b][/align]&V^,k.{`)Dv
1. 可以非常有效的鉴定某一蛋白质（或表位）的性质；结合免疫沉淀法，可以用来定量分析小分子抗原 。
"wEtH/Q0? V M 2. 表位作图2M+T/XB&n
3. 结构域分析
~'p*X.G3fk 4. 斑点印迹，可用层析组分，蔗糖梯度或脉冲追踪实验分析
G8aw
KQ/KS 5. 功能实验中蛋白质复性ar|dG9eBYSd
6. 配基结合，免疫印迹后多种配基可同蛋白质进行配基结合试验。
0[+XZ\/P#k UQV 7. 抗体纯化!D(k}!V)D LZ7`
8. 有膜上收获蛋白质条带制备抗体
Ckr aN IB$Y 9. 氨基酸组成分析和序列分析，极微量蛋白质（10pmol）转移到PVDF膜上或可进行氨基酸组成分析和序列分析。转移的蛋白质或多肽条带可经考马斯亮蓝染色后切下进行氨基酸组成分析或序列分析。

phyllis03 发表于 07-8-13 17:39

Western Blot 常见问题分析

**** Hidden Message *****J$A/@cm;K
aV%KSP&[s
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:46 编辑 [/i]]

nano 发表于 07-8-13 20:06

3楼中　　14. 考马斯亮蓝染色法试剂：一般用R-250考马斯亮蓝（蛋白定量专用） ?2v@-b*v'l i6U
定量是G250

phyllis03 发表于 07-8-13 20:40

回复 #7 nano 的帖子

谢谢关注和指教！ q.t ^6ya$V2C0`
已经修改

蛋白丫头 发表于 07-8-14 20:34

关于胶的染色

我们实验室通常用R350染色，但脱色时间较长。用G250染色也可以，但染的时间较长，无须脱色，背景清晰

phyllis03 发表于 07-8-14 21:14

回复 #9 蛋白丫头 的帖子

谢谢分享经验！

lonelywind 发表于 07-10-3 15:11

太好了

本人正需要学习这方面的知识，感谢楼主！！

nocaackoei 发表于 07-11-29 20:45

2楼说 HM1[l+kF(T Q7Y o*B
固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
wE)aS4pb
[/i%A1vsD^ 6楼又说
*}wy+`rXF@ 因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。zO5Gdem2GqK

IG/u5d(J5[(k+U 到底是不是变性的啊，我都糊涂了
m
e{I(_ z7PV 我记得听老师说过western blotting是部分变性或者变性，也有可能不变性只是活性下降。

dingleipang 发表于 07-12-1 08:46

:lol good

shale 发表于 08-3-9 09:08

太好了，正需要:excellent:

困惑mxy 发表于 08-3-9 20:38

正要用，谢谢楼主！

djp0936 发表于 08-3-12 12:14

kan kan 先

zyjjkw 发表于 08-3-14 10:36

滴上DAB显色液后背景很亮是啥原因呀?

和以前的条件一样没有这样过呀,谢谢指教

biohl 发表于 08-3-17 10:08

不错，学了很多，多谢了！

zk1718 发表于 08-3-22 10:51

好东西！！:lol :lol :lolusop\'@XD
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[url=http://www.zk1718.com/]中科仪器仪表网[/url] [url=http://www.zk1718.com/yiyeqi/]移液器[/url] [url=http://www.zk1718.com/zhipuyi/]质谱仪[/url] [url=http://www.zk1718.com/chaoshengposuiyi/]超声破碎仪[/url] [url=http://www.zk1718.com/jiyinkuozengyi/]基因扩增仪[/url][url=http://www.zk1718.com/dianyongyi/]电泳仪\电泳槽[/url] [url=http://www.zk1718.com/lidufenxiyi/]粒度分析仪[/url][url=http://www.zk1718.com/zhanduji/]粘度计[/url] [url=http://www.zk1718.com/yaochuang/]摇床[/url] [url=http://www.zk1718.com/%E9%85%B6%E6%A0%87%E4%BB%AA/]酶标仪[/url] [url=http://www.zk1718.com/gelimage/]凝胶成像系统[/url] [url=http://www.zk1718.com/ziwaifenxiyi-ziwaijianceyi/]紫外分析仪/紫外检测仪[/url] [url=http://www.chinagolfbiz.com/]中国高尔夫商务网[/url] [url=http://www.uu258.cn/]悠悠时尚网[/url]
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~p YHb(t]Uq9s [[i] 本帖最后由 zk1718 于 08-3-22 11:14 编辑 [/i]]

pangchaojian 发表于 08-3-22 20:40

楼主真做western 的高手

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