免疫PCR（Immuno PCR，Im-PCR）
[color=#000000][size=2][font=宋体][align=center][size=11pt][b]免疫PCR(Im-PCR)[/b][/size][/align][font=宋体][size=11pt]主要内容：[/size][/font][font=Tahoma][size=11pt]
[font=Times New Roman]1.[/font][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8184&page=1#pid31575][color=#154ba0][font=宋体]免疫[/font][/color][color=#154ba0][font=Times New Roman]PCR[/font][/color][color=#154ba0][font=宋体]基本原理[/font][/color][/url]"V ^ rA'Ef z Qa nne
[font=Times New Roman]2.[/font][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8184&page=1#pid31576][color=#154ba0][font=宋体]免疫[/font][/color][color=#154ba0][font=Times New Roman]PCR[/font][/color][color=#154ba0][font=宋体]的种类[/font][/color][/url]6WX4c6@6Q F_H,c}m%s
[font=Times New Roman]3.[/font][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8184&page=1#pid31577][color=#154ba0][font=宋体]免疫[/font][/color][color=#154ba0][font=Times New Roman]PCR[/font][/color][color=#154ba0][font=宋体]基本实验步骤[/font][/color][/url]W kf)e4V C8Gc3HN5ma
[font=Times New Roman]4.[/font][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8184&page=1#pid31578][color=#154ba0][font=宋体]免疫[/font][/color][color=#154ba0][font=Times New Roman]PCR[/font][/color][color=#154ba0][font=宋体]产物检测及定量技术[/font][/color][/url],_8t(b,z] `
[font=Times New Roman]5.[/font][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8184&page=1#pid31579][color=#154ba0][font=宋体]免疫[/font][/color][color=#154ba0][font=Times New Roman]PCR[/font][/color][color=#154ba0][font=宋体]要点[/font][/color][/url]
[font=Times New Roman]6.[/font][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8184&page=1#pid31580][color=#154ba0][font=宋体]免疫[/font][/color][color=#154ba0][font=Times New Roman]PCR[/font][/color][color=#154ba0][font=宋体]优化策略及改进[/font][/color][/url]
[font=Times New Roman]7.[/font][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8184&page=1#pid31581][color=#154ba0][font=宋体]免疫[/font][/color][color=#154ba0][font=Times New Roman]PCR[/font][/color][color=#154ba0][font=宋体]注意事项[/font][/color][/url]
[font=Times New Roman]8.[/font][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8184&page=1#pid31582][color=#154ba0][font=宋体]免疫[/font][/color][color=#154ba0][font=Times New Roman]PCR[/font][/color][color=#154ba0][font=宋体]的应用及发展[/font][/color][/url][/size][/font]
[font=Tahoma][/font]9P y2q3dfA
[b][font=宋体][size=11pt]声明：[/size][/font][/b][b][size=11pt][/size][/b]
[size=11pt][font=Times New Roman]1、[/font][/size][font=宋体][size=11pt]本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍，由酷友搜集、分析、整理、审改，供大家学习参考用，如有转载、传播请注明源于[/size][/font][size=11pt][url=http://www.genecool.com/][font=宋体][color=#0000ff]基因酷[/color][/font][/url][/size][font=宋体][size=11pt]及[font=宋体][size=11pt]本篇[/size][/font]的工作人员；若[font=宋体][size=11pt]本篇[/size][/font]侵犯了您的版权或有任何不妥，请[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]Email [/font][email=genecool@126.com][font=Times New Roman][color=#0000ff]genecool@126.com[/color][/font][/email][/size][font=宋体][size=11pt]告知。[/size][/font][size=11pt][/size]
[size=11pt][font=Times New Roman]2、[/font][/size][font=宋体][size=11pt]由于我们的学识、经验有限，[font=宋体][size=11pt]本篇[/size][/font]难免会存在一些错误及缺陷，敬请不吝赐教：请到基因酷论坛（[/size][/font][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs][font=Times New Roman][color=#800080]www.genecool.com/bbs[/color][/font][/url][/size][font=宋体][size=11pt]）[font=宋体][size=11pt]本篇[/size][/font]对应的专题跟贴指出或[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]Email [/font][email=genecool@126.com][font=Times New Roman][color=#0000ff]genecool@126.com[/color][/font][/email][/size][font=宋体][size=11pt]。[/size][/font][size=11pt][/size]2OR6NY H X{
[b][font=宋体][size=11pt]致谢：[/size][/font][/b][b][size=11pt][/size][/b]/? E~7hp8D&_+[
[font=宋体][size=11pt]整理者：[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]microfox [/font][/size][font=宋体][size=11pt]审改者：[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]wny[/font][/size]
[font=宋体][size=11pt][/size][/font]
[font=宋体][size=11pt]主要参考资料：[/size][/font]XB!nl,A
[font=宋体][size=11pt]《免疫[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]方法的研究进展》[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]中国人民解放军第[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]253[/font][/size][font=宋体][size=11pt]医院免疫中心[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]额尔敦[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]郭美香[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size]
[font=宋体][size=11pt]《免疫[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]-PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]技术进展》 [/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]南京铁道医学院生物学教研室[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]洪泽辉[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman] [/font][/size][font=宋体][size=11pt]张丽珊[/size][/font][size=11pt][/size]
O q%C D ]*L
[/font][/size][/color]
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 09:11 编辑 [/i]]
免疫PCR基本原理
**** Hidden Message *****^.md*O(FZ,TN N[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:43 编辑 [/i]]
免疫PCR种类
[align=center][b]免疫PCR的种类[/b][/align] V:f n^7W@1H |4h[b]（1）原位免疫PCR（in situ immuno,PCR）[/b] ~t w(l S,p#Oi
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，是一种原位检测组织或细胞中抗原的技术。它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。
原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。
其基本方法为
① 固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。;[q)SdDt Y
②蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K。
③PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。
④杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。
⑤显微镜观察结果。Q2xrA,dk)J"m
待检石蜡切片上的非特异性结合位点经过充分封闭，内源性DNA和RNA经核酶充分消化后，通过生物素化单抗与亲和素系统的桥联，将生物素化的DNA报告分子固定在石蜡切片上，进行原位PCR扩增，扩增产物经原位核酸杂交，以杂交信号指示待测抗原是否存在。Cao用原位免疫PCR检测肝石蜡切片上的乙肝表面抗原（HBsAg），其敏感性较免疫组化法显著提高。 Z Wq lL Y
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏感性高于一般的PCR.
[b]（2）细胞免疫PCR（cellular immuno，PCR）[/b]
通常用来检测细胞表面膜抗原。Zhang用此法成功的检测了白血病病人血清中转移癌细胞上的肿瘤抗原GM3。首先用抗CM3单抗制备单抗-亲和素-生物素化复合体，然后分离病人外周血淋巴细胞，充分洗涤封闭后，与单抗DNA复合体共育，洗涤后抽提细胞总DNA，利用DNA报告分子的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经Southern blot显示结果，病人外周血淋巴细胞可扩增出300bp的特异性条带，正常人无。
[b]（3）多分析物免疫PCR[/b]
利用大小不同的DNA分子标记不同的抗体，可同时检测多种抗原。Joerger用99个碱基的DNA分子标记hCG抗体，用88个碱基的DNA分子标记hT-SH抗体，同时检测hCG、hTSH两个分析物，两个DNA报告分子共用一对引物，但PCR产物的分子量不同，从而使两个抗原得以鉴别。
[b]（4）单引物免疫PCR[/b] ,\_H~'nT&i.X
即DNA报告分子的两侧累含有相同的引物序列，可用单引物进行PCR扩增。该法可提高PCR扩增效率，且适合于多分析物免疫PCR。
免疫PCR基本实验步骤
**** Hidden Message ***** t$K*zKL8`^f n[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:44 编辑 [/i]]
免疫PCR产物检测及定量技术
**** Hidden Message *****[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:44 编辑 [/i]]
免疫PCR要点
**** Hidden Message *****I Z6] ` [ z!fyb;u RB3\8a
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:44 编辑 [/i]]
免疫PCR优化策略及改进
[align=center][b]免疫PCR优化策略及改进[/align][/b]
[b]（1）免疫PCR的优化策略——新型连接分子的出现[/b]
1）叶绿素分子和链酶卵白素 ~&C}Y*v&^
乔生军等用自然界普遍存在的叶绿素分子（chlorophy）作为共价连接蛋白与核酸的中间分子，构建了甲胎蛋白（AFP）抗体的基因探针，此探针人为地把抗体直接锚定在双链DNA分子上，复合分子性质均一稳定，室温至少保存6个月，大大简化了中间步骤，降低了成本，使免疫PCR更易推广。也有人用链酶卵白素将生物素化的抗体与生物素化的DNA分子直接连接，也得了良好的较果。1tc1Y-t m
2）双特异融合蛋白
任军将编码单链抗体和链亲和素融合蛋白的基因插入载体在大肠杆菌中进行表达，获得了具备结合生物素和抗原分子的双特异性融合蛋白，可直接连接抗体和生物素化的DNA分子。该融合蛋白可利用工程菌大量制备，性质优良，价格低廉。 ?:]F1L+n U"R;[X
3）生物素化F(ab′)2段代替生物素化单抗
抗体的Fab或F(ab′)2易于标记，且因缺乏Fc段大大降低了非特异性吸附的可能性，使免疫PCR的本底大为降低。Yashito用胃蛋白酶消化单抗，把得到的Fab段用生物素标记，以此来检测ANP，使其特异性大为提高。zG+O!m/E S+H7U
[b]（2）免疫-PCR的改进[/b]
虽然Sano等人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了它在实际应用中的广泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-PCR系统。Ruzicka用此免疫-PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体。可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。此外，Sano的免疫-PCR实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。Zhou等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液（modified antigen dilution buffer, MADB）代替Sano免疫-PCR中的TBS作为抗原稀释液，它主要把TBS中胍的浓度调到2M，由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETSI，检测浓度可达到9.6×10-15M，是常规ELISA的105倍。与Sano的免疫-PCR系统相比，Ruizicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素（链亲和素）都已经商品化，因此在实际操作中得到广泛应用。但直接包被待检抗原不适用于临床标本和难以吸附固相抗原的检测。随后在一系列实验中建立了各种夹心免疫-PCR，扩大了检测范围。然而亲和素（链亲和素）作为一个连接分子对生物素的结合具有4价特性，亲和素与生物素化DNA结合可得到5种不同产物，即游离亲和素、结合饱和亲和素和部分饱和亲和素才能在检测过程中发挥作用，游离亲和素与固相中生物素化抗体结合会降低方法的敏感性。
[b]（3）免疫-PCR新技术——多分析物免疫-PCR[/b] @&m fa6C8vq,~&A:G
在以上的免疫-PCR实验中，生物素化的DNA通过不同的生物素结合试剂（链亲和素、亲和 素）连接到生物素化的抗体上。这样，DNA标记和抗体就被组装在同一位点上，因此可能产生可变的化学计量。另外它需要额外的步骤加入生物素试剂和连接试剂，并需要众多的洗涤步骤去除过量的试剂和非特异性连接试剂的实验组分，作为一个免疫-PCR实验就相当复杂且需要相当多的操作时间。Hendrickson等人用异双功能化学交联剂预先连接好抗体和ssDNA标记，形成标记DNA-抗体偶联物。特别是，他将不同的抗体标上特异的DNA序列，形成一种新的、基于双抗夹心免疫模式的免疫-PCR，并可同时检测多种抗原，避免了免疫实验敏感性的限制和在一个实验中检测抗原的种类。而且，免疫-PCR夹心模式可以用常规的免疫实验完成。这样就大大降低了原先免疫-PCR实验的复杂性，并减少了大量的操作时间。这种免疫-PCR系统的关键改进就是用异双功能化学关联剂制备标记DNA-抗体偶联物。制备过程如下：
1） 氨基修饰寡核苷酸与SATA反应，形成乙酰硫代乙酰修饰DNA。
2） Sulfo-SMCC与抗体反应，形成马来酰亚胺修饰抗体。w[r&i I7c?
3） 混合马来酰亚胺修饰抗体和乙酰硫代乙酰修饰DNA，并加入羟胺盐酸，在黑暗条件下反应，使抗体和标记DNA偶联。
4） 反应混合物用HPLC凝胶过滤纯化偶联物，收集的偶联物在4℃下保存。:SASn+KK ~$]
在这偶联物中，ssDNA是连在抗体的Fc段上，因此并不影响抗体的活性。Hendrickson用此方法把设计独特的三种寡核苷酸（分别为55、85、95个碱基）分别共价连接到三种分析物hTSH、hCG、β-Gal的特异性抗体上，每一个寡核苷酸标记物含有相同的引物序列。这样，一对引物就可以促成三种DNA的共同扩增，Hendrickson用预先制备好的三种抗体-RNA偶联物同时检测hTSH、hCG、β-Gal实验使用双抗夹心模式。实验结果表明，分析物检测的敏感度超过普通ELISA约三个数量级。
由于化学合成寡核苷酸标记物序列长度不能超过100个碱基。因此，在多分析物免疫-PCR实验中，ssDNA标记物和引物的设计就受到了限制。Joerger等人用dsDNA作为标记物与抗体偶联。几千个bp的dsDNA可以通过生物学和生物化学方法制备。Joerger通过PCR和单向缺失在以Puc18为基础的重组质粒上制备了各种长度、具有相同引物序列的的dsDNA，选择适合长度的dsDNA作为特异性抗体的标记物。另外，在免疫-PCR实验中，dsDNA比ssDNA具有更多的优越性。DsDNA中的一条链跟抗体的Fc段连接，另一条链在PCR第一步变性步骤中就释放到溶液中，使链复制没有空间位阻。而且dsDNA比ssDNA具有更高的稳定性。此外，长链DNA分子更容易用荧光标记和光吸收检测，并且可以引入更多的非同位素标记，序列长度的提高可以促进杂合检测。
免疫PCR注意事项
[align=center][b]免疫PCR注意事项[/b][/align]2M.} _S{%r
本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上DNA片段。
此外，还可用化学方法将DNA片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的DNA片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用N-Succinimidyl-S-acetyl thioacetate(SATA)活化氨基修饰的DNA片段，用Sulfo-Succinimidyl 4-(maleimidomethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修饰抗体分子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲（Hydroxylamine hydrochloride）使二者偶联在一起。2?U P3\iY;O F
免疫PCR具有高敏感性。因此，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了，亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真，重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。
免疫PCR的一个优点是标记DNA序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换，以避免由于污染造成的假阳性信号。
免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此，应用免疫PCR可在微观水平（单细胞）检测抗原，定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。
免疫PCR的应用及发展
[align=center][b]免疫PCR的应用及发展[/b][/align]
[align=left] 免疫PCR的高敏感性使低于常规检测方法极限的痕量抗原的检测成为可能。但目前免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，还没有一个十分成熟和满意的方法，配套试剂尚缺乏，所以应用的还不多，在报道的几种方法中均是用一些已知的标准品进行试验，主要用于检测肿瘤标志物、细胞因子、神经内分泌活性多肽、病毒抗原、细菌、酶、支原体、衣原体等微量抗原。Sano，Ruzicka和Hong zhou分别用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重组人原癌基因产物ETS;蛋白作为待检抗原进行免疫PCR，他们的结果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。
目前介绍的免疫PCR还存在一些缺点，在报道的文献中均采用待检抗原直接吸附固相，这样固相的均质性必然对结果有很大的影响;同时检测的样品液中其它成分也可以吸咐固相，极易产生背景过高或精确度下降。
免疫PCR以现存检测无可比拟的高敏感性显示了巨大的优越性，必将在疾病的诊断中发挥巨大的作用。但目前该技术尚未完全成熟，免疫PCR过程中的每一环节都影响它的敏感性和特异性，因此探索最佳反应条件，简化步骤，降低费用，实现标准化，商品化生产，使之易于在基层推广至关重要。近年来国内外学者在这方面做了大量工作，其中新型连接分子是关键，随着基因工程、化学合成及二次杂交等技术的进步，双特异性抗体、双特异性重组蛋白、双特异性化学合成分子等新型连接分子的不断涌现，使抗体与DNA分子直接连接，为解决上述问题提供了有利条件。'N q.|.enb {mlC,v
另外，有些难于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR检测，连接分子的特异性和均质性对PCR影响很大，从理论上看Hong zhou的生物素标记抗体和DNA以及用游离的链亲和素连接抗体和DNA是一比较理想的方法，但是如能做到生物素化抗体、亲和素和生物素化DNA3个分子预先连接一个复合物，那么将简化实验过程。PCR扩增过程相对简单，如用微量板作为固相需选用配套的PCR仪，否则需将其移入反应管内，这必然导致很大的误差，经放大可产生显著差异。固相也可以直接采用某些PCR反应管，并且可以直接用一般的PCR仪进行扩增，但冲洗过程相对复杂一些。免疫PCR具有非广泛的应用前景，十分有必要进一步完善免疫PCR的实验过程和配套试剂的研制。[/align] 谢谢版主了,我过几天可能正要用它. :qq68: 收藏了。 好东西啊 谢谢 我看看 谢谢版主了,长见识了 除了强大还能说啥？除了强大还能说啥？除了强大还能说啥？除了强大还能说啥？
页:
[1]